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动物源性产品物种鉴别基因宏条码技术高通量测序法标准立项报告

英文标题

StandardizationProjectReportonHigh-ThroughputSequencing-BasedDNAMetabarcodingforSpeciesIdentificationinAnimal-DerivedProducts

摘要

随着动物源性产品市场的快速发展，其物种成分的真实性与安全性问题日益受到关注。传统基于Sanger测序的DNA条形码技术虽在单一物种鉴定中表现成熟，但在处理多物种混合样品时存在技术瓶颈，如无法有效分离共存物种的DNA片段，需依赖克隆测序，导致成本高、耗时长且准确性不足。为突破此局限，高通量测序技术应运而生，其通过大规模并行测序与克隆扩增策略，实现了对复杂样品中所有物种（包括痕量成分）的高通量、高灵敏度检测。本标准旨在建立基于高通量测序的基因宏条码技术体系，涵盖哺乳类、禽类、鱼类等动物及其制品的多物种混合样品定性检测。通过优化实验流程、开发自动化生物信息学分析工具及方法学验证，形成一套操作简便、成本可控、精准可靠的物种鉴别标准，为动物源性产品监管与溯源提供技术支撑，推动行业规范化发展。

关键词

动物源性产品；物种鉴别；基因宏条码；高通量测序；多物种混合样品；生物信息学分析；标准化

*Keywords:Animal-derivedproducts;Speciesidentification;DNAmetabarcoding;High-throughputsequencing;Multi-speciesmixtures;Bioinformaticsanalysis;Standardization*

正文

一、目的与意义

传统的Sanger测序技术作为DNA条形码的核心方法，已广泛应用于物种鉴定领域。其通过扩增特定基因片段（如COI、16SrRNA）并进行单向测序，可实现单一物种的精准识别。然而，该技术在处理包含多种物种的混合样品时存在显著缺陷：由于各物种DNA扩增产物长度相近，凝胶电泳无法有效分离不同物种的条带，导致直接测序无法获取混合样品的完整物种信息。为解决此问题，需借助克隆测序技术，即将扩增产物导入大肠杆菌进行克隆培养后分别测序。该方法不仅操作繁琐、周期长达数周，且成本高昂，尤其在未知物种数量的样品中易出现漏检或误判，限制了其在实际监管中的应用。

为克服Sanger测序通量低的局限性，Margulies等人于2005年开创了新一代测序技术。该技术最初被称为“新一代测序”，其核心特征是通过大规模并行处理，在单次运行中同时完成数百万条DNA片段的测序。相关术语如高通量测序、大规模平行测序及克隆测序常作为其同义词使用。高通量测序技术的出现彻底改变了生物学研究范式，其以更低成本、更高效率获取海量序列数据的能力，为复杂样品的物种分析提供了全新解决方案。

目前主流的高通量测序技术包括焦磷酸测序与Solexa测序。焦磷酸测序基于天然核苷酸与实时信号检测原理，通过乳液PCR将DNA模板固定于磁珠，并在PicoTiterPlate平板中通过焦磷酸释放触发荧光反应，实现碱基序列的实时读取。该技术由454LifeSciences公司商业化推广，显著提升了测序通量。与之并行的Solexa测序（后由Illumina公司收购）则通过片段化DNA、桥式PCR扩增形成“簇”，并利用可逆终止的边合成边测序技术，通过荧光信号采集获取序列信息。这些技术通过并行化与克隆扩增策略，大幅提升了从降解或复杂DNA样本中获取信息的能力，尤其适用于检测食品基质中的痕量非预期物种。

基于高通量测序的基因宏条码技术，在传统DNA条形码基础上进一步整合了优化实验流程与生物信息学分析方法，建立了高效、精准的动物源性产品物种鉴别体系。该技术通过通用引物扩增混合样品中的多物种DNA，结合高通量测序与自动化数据分析，可实现哺乳类、禽类、鱼类等动物及其制品（如肉、血液、毛发、骨角等）的真伪鉴别。本标准通过系统优化技术参数与分析方法，旨在形成一套易操作、低成本、高灵敏度的标准化鉴别方案，为动物源性产品真实性监管与溯源管理提供核心技术支持，并为行业规范制定提供参考依据。

二、范围与主要技术内容

本标准规定了动物源性产品物种鉴别中基因宏条码技术的高通量测序方法，适用于哺乳类、禽类、鱼类动物的肉、血液、毛发、角骨、内脏、皮张等来源的单一或多物种混合样品，以及饲料中动物成分的定性检测。其主要技术内容涵盖以下三个方面：

1.高通量测序技术操作流程的标准化研究

（1）动物通用引物的筛选：针对线粒体基因（如COI、Cytb、12SrRNA）设计并验证跨物种通用引物，确保其对目标类群（哺乳类、禽类、鱼类）具有高扩增效率与特异性