T细胞体外培养与扩增技术指导.docxVIP

T细胞体外培养与扩增技术指导

引言

T淋巴细胞（T细胞）作为适应性免疫系统的核心组成部分，在机体抵御病原体入侵、肿瘤监视以及维持免疫稳态中发挥着至关重要的作用。随着现代免疫学、细胞生物学以及基因工程技术的飞速发展，T细胞体外培养与扩增技术已成为基础研究、肿瘤免疫治疗（如CAR-T、TCR-T）、过继性细胞免疫治疗（ACT）等领域不可或缺的关键支撑。本技术指导旨在系统阐述T细胞体外培养与扩增的核心原理、关键步骤、常见问题及解决方案，为相关领域的研究人员提供一套相对完整且实用的操作参考，以期提高实验成功率与细胞产品质量。

一、前期准备与实验室要求

T细胞体外培养与扩增是一个精细且对环境要求较高的过程，前期准备的充分与否直接关系到后续实验的成败。

1.1实验室环境与生物安全

操作应在符合生物安全二级（BSL-2）及以上标准的细胞培养实验室进行。核心区域包括：

*洁净工作台/生物安全柜：所有涉及细胞操作的步骤均需在此进行，以确保无菌环境并保护操作者。应定期验证其高效空气过滤器（HEPA）的完整性和气流速度。

*细胞培养箱：维持37℃、5%CO?、饱和湿度的培养环境。CO?浓度和温度需每日监测，水盘应定期更换无菌水并清洁，防止污染。

*辅助区域：配备倒置显微镜、离心机、冰箱（4℃、-20℃、-80℃）、液氮罐、高压灭菌器等设备。实验室应建立严格的清洁消毒制度和人流物流通道。

1.2主要仪器设备

除上述核心设备外，还需准备：

*离心机：水平转子，用于细胞洗涤、分离。

*倒置显微镜：用于每日观察细胞形态、生长状态及有无污染。

*计数仪：如血球计数板配合显微镜，或自动化细胞计数仪（如台盼蓝排斥法、荧光染色法），用于精确计数细胞浓度及活率。

*移液器及配套吸头：选择不同量程的精密移液器，吸头应为无菌、无热源、无DNA酶/RNA酶。

*培养器皿：根据培养规模选择培养皿、培养瓶、离心管、T25/T75/T175细胞培养瓶或细胞培养袋。均需为无菌、无热源、经过表面处理（适合贴壁或悬浮培养）。

1.3关键试剂与材料

*基础培养基：常用RPMI1640、IMDM或X-VIVO系列等。应选择高质量、批次稳定的商品化培养基，储存于2-8℃，避光。使用前需预热至37℃。

*血清或无血清替代物：胎牛血清（FBS）是传统的细胞培养添加剂，能提供细胞生长所需的多种营养成分和生长因子。但在临床应用或特定实验中，需使用无血清培养基或人AB血清，以减少异种蛋白污染风险和批次差异。血清使用前通常需56℃灭活30分钟以去除补体活性，并进行严格的批次筛选和质量检测。

*细胞因子：T细胞活化与增殖的关键驱动因素。

*白细胞介素-2（IL-2）：最常用的T细胞生长因子，能有效促进活化T细胞的增殖和存活。

*其他细胞因子：根据实验目的，可能还需要IL-7、IL-15、IL-21等，以调节T细胞的分化方向、记忆表型维持或增强特定功能。细胞因子通常为冻干粉，需按照说明书溶解、分装并储存于-20℃或-80℃，避免反复冻融。

*活化试剂：

*抗CD3单克隆抗体：用于模拟T细胞受体（TCR）信号，激活T细胞。

*抗CD28单克隆抗体：用于提供共刺激信号，增强活化效果并减少T细胞凋亡。

*CD3/CD28磁珠：将抗CD3和抗CD28抗体偶联到磁性微珠上，可高效、便捷地活化T细胞，且易于通过磁场分离去除。这是目前主流的活化方法之一。

*分离试剂：如密度梯度离心液（如Ficoll-Paque），用于从外周血、脐带血或其他组织中分离单个核细胞（PBMC）。

*消化酶（如适用）：如胰蛋白酶，用于贴壁细胞的消化传代，但T细胞通常为悬浮生长，此步骤较少使用。

*冻存液：常用含10%-20%DMSO（或其他冻存保护剂如甘油）和FBS的培养基，或商品化无血清冻存液。DMSO需为细胞培养级。

*缓冲液：PBS（磷酸盐缓冲液），用于洗涤细胞、稀释试剂等。

*台盼蓝或其他活细胞染色剂：用于细胞活力检测。

二、T细胞的分离与活化

2.1起始细胞材料的获取

T细胞的来源多样，包括外周静脉血、脐带血、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）、淋巴结、脾脏等。最常用的是外周血单个核细胞（PBMC）。获取血液样本需遵循伦理规范和相关操作规程。

2.2PBMC的分离（以密度梯度离心法为例）

1.样本处理：将抗凝全血用PBS按1:1或1:2比例稀释，充分混匀。

2.密度梯度离心：在离心管中加入适量密度梯度离心液，将稀释后的血液缓慢叠加于离心液上层，注意保持界面清晰。

3.离心：室温下，以一定的离心力（通常为400-600×g）离心20-30分钟，离心过程中应避免刹车过急。

4.细