组培过程中异常问题诊断与处理96课件.pptxVIP

组培过程中异常问题诊断与处理;任务褐变问题及解决办法;;褐变原理：

褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少和多酚氧化酶活性有直接关系。这些酚类化合物在完整的组织和细胞中，与多酚氧化酶是分隔存在的，因而比较稳定。但在建立外植体时，切口附近的细胞受到伤害，其分隔效应被打破，酚类化合物外溢。但酚类很不稳定，在溢出过程中与多酚氧化酶接触，在多酚氧化酶的催化下迅速氧化成褐色的醌类物质和水，醌类又会在酪氨酸酶等的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，从而导致组织代谢紊乱，生长停滞不，最终衰老死亡。;二、褐化的主要原因

（1）品种：由于多酚氧化酶活性上的差异，有些品种的外植体在接种后较易褐变，而有些品种的外植体在接种后不易褐变。如一般木本植物，单宁、色素含量高的植物易发生褐变。核桃单宁含量很高，在进行组织培养时难度很大，不仅接种后的初代培养期发生褐变，而且在形成愈伤组织以后还会因为褐变而出现死亡。

（2）生理状态：一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。（幼龄材料酚类化合物含量少，而成龄材料比较多。）;（3）取材部位

如苹果顶芽作外植体褐变程度轻，比侧芽容易成活。石竹和菊花也是顶端茎尖比侧芽茎尖更容易成活。油棕用幼嫩器官或组织，如胚等作为外植体进行培养，褐变较轻，而用高度分化的叶片作外植体，接种后则很容易褐变。总之，分生部位接种后醌类物质形成少；而分化部位接种后醌类物质形成多。

（4）取材时期

如24个苹果品种进行茎尖培养时发现，以冬春季取材褐变死亡率最低，其他季节取材则都有不同程度地加重。核桃的夏季材料比其他季节材料更易氧化褐变，因而一般都选在早春或秋季取材。造成这种季节性差异的原因，主要是由于植物体内酚类化合物含量和多酚氧化酶活性呈季节性变化，植物在生长季节都含有较多的酚类化合物之故。多酚氧化酶活性和酚类含量基本是对应的，春季较弱，随着生长季节的到来，酶活性逐渐增强，因而有人认为取材???期比取材部位更加重要。;（5）外植体大小及受伤害程度

如金冠苹果茎尖小于0.5mm时褐变严重,当茎尖长度在5mm～15mm时褐变较轻,成活率可达85%。另外，取外植体时还要考虑其粗度，细的可切短些，粗的可切得长些。

外植体组织受伤害程度直接影响褐变。为了减轻褐变，在切取外植体时，应尽可能减小其伤口面积，伤口剪切尽可能平整些。用椰子的完整胚、叶片作外植体进行培养，很少发生褐变。除了机械伤害外，接种时各种化学消毒剂对外植体的伤害也会引起褐变。酒精消毒效果很好，但对外植体伤害很重；氯化汞对外植体伤害比较轻。

一般来讲，外植体消毒时间越长，消毒效果越好，但褐变也越严重，因而，消毒时间应掌握在一定范围内，才能保证较高的外植体成活率。;（6）培养条件不当：例如光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。

（7）培养基成分：pH值与浓度过高的无机盐会使褐化程度增加，激素的种类或浓度也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐化现象加深。如6－BA或KT能促进褐变发生，而生长素类如IAA可减轻褐变发生。

（8）材料转瓶周期：对于易褐变的材料，接种后转瓶时间长，伤口周围积累醌类物质增多，褐变加重，以致全部死亡。而缩短转瓶周期可减轻褐变。

;三、防治措施

（1）选择合适的外植体及正确的处理：一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体。春季取外植体，褐变发生较轻。夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐变要严重。冬季的芽不易生长，宜选用早春和秋季的材料作为外植体。

预处理能减轻醌类物质的毒害作用。处理方法如下：外植体经流水冲洗后，在2-5℃的低温下处理12-24小时，再用升汞或70％酒精消毒，然后接种于只含有蔗糖的琼脂培养基中培养5-7天，使组织中的酚类物质部分渗入培养基中。取出外植体用0.1％漂白粉溶液浸泡10分钟，再接种到合适的培养基中。若仍有酚类物质渗出，3-5天后再转移培养基2-3次，当外植体的切口愈合后，酚类物质减少，这样可使外植体褐变减轻或完全被抑制。

;（2）合适的培养条件：低浓度的无机盐可促进外植体的生长与分化，减轻外植体褐变的程度；适当的激素浓度；培养基的硬度大，褐化减轻；培养基中硬度低的蒸馏水褐变率低，而使用硬度较高的自来水，褐变严重，甚至会出现褐变死亡。这可能是配制培养基的水改变了培养基中无机盐的浓度，间接地影响了植物外植体的褐变。

如温度过高或光照过强，光照会提高PPO的活性，促进多

酚类物质的氧化，从而加速被培养的组织褐变。高浓度CO2也会促进褐变，初期培养要在黑暗或弱光下进行。;（3）