鱼载脂抗冻蛋白在毕赤酵母中的胞内表达及其活性分析.pdfVIP

第11卷第1期生物化工Vol.11No.1

2025年2月BiologicalChemicalEngineeringFeb.2025

doi:10.20284/ki.swhg.2025.01.018研究报告

鱼载脂抗冻蛋白在毕赤酵母中的胞内表达

及其活性分析

耿嫦慧

（上海海洋大学水产与生命学院，上海201306）

摘 要：目的：选用冰鱼来源的载脂蛋白（Apolipoprotein）序列修饰的抗冻蛋白（AntifreezeProtein，AFP）基因——鱼载

脂抗冻蛋白（fishApolipo-AntifreezeProtein，fApoAFP）基因作为目的基因，对其在毕赤酵母中进行胞内表达，并对表达产物进

行纯化及蛋白活性分析。方法：将真核表达质粒pPICZαA-fApoAFP利用大肠杆菌进行扩增并进行线性化处理。通过电转化

法转化于感受态毕赤酵母X-33，并进行甲醇利用表型及高拷贝菌株筛选。甲醇诱导重组蛋白表达，提取酵母胞内蛋白并进行

SDS及Westernblot鉴定。对鉴定成功的转化子进行大量诱导，对胞内蛋白进行亲和层析纯化、透析及真空冻干。最后

在293T细胞培养基中分别添加终浓度为1mg/mL和5mg/mL的fApoAFP，-80℃处理24h，检测fApoAFP是否有助于改善

冷冻处理后细胞的存活率。结果：成功获得2株高拷贝甲醇利用正常型（Mut＋）菌株，并对fApoAFP蛋白成功进行了表达和纯化，

相对分子质量为37kDa。然而通过293T细胞冷冻实验发现，fApoAFP未能够改善冷冻处理后的293T细胞增殖能力及其存活率。

结论：鱼载脂抗冻蛋白fApoAFP能够在毕赤酵母X-33中成功表达并纯化，然而对293T细胞未表现出良好的低温保护作用。

关键词：抗冻蛋白；毕赤酵母；蛋白表达；蛋白纯化

中图分类号：Q789    文献标识码：A    文章编号：2096-0387（2025）01-095-07

Expression Intracellularly of Fish Apolipo-Antifreeze Protein in Pichiapastoris 

and Its Activity Analysis

GENG Changhui

(College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Abstract: Objective: The fish apolipo-antifreeze protein (fApoAFP) gene, an antifreeze protein gene modified by the

fish apolipoprotein gene sequence, is expressed intracellularly in Pichiapastoris which its expression product is purified

α

and analyzed for activity. Methods: The eukaryotic expression plasmid pPICZA-fApoAF