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基于MSAP技术解析小麦与叶锈菌互作的表观遗传响应机制

一、引言

1.1研究背景

小麦作为全球重要的粮食作物之一，其产量和品质直接关系到国家粮食安全和人民生活的稳定。然而，小麦叶锈病作为一种由小麦叶锈菌引起的真菌病害，严重威胁着小麦安全生产。该病害通过感染小麦叶片，导致叶片枯黄、早衰，严重时可造成小麦减产30%以上，甚至绝收。近年来，随着全球气候变暖，小麦叶锈病的发生和流行趋势愈发严峻，已成为我国华北及黄淮麦区的重要病害之一，对小麦生产构成了巨大影响。

小麦叶锈病是一种全球性小麦病害，在许多国家的不同小麦主产区均有不同程度的发生。叶锈菌小种的毒性变异频繁，许多抗病基因逐渐失效，导致小麦品种易丧失抗病性，这使得抗病育种工作面临巨大挑战。目前，利用抗病品种是防治小麦锈病最为经济有效且绿色安全的途径。但我国虽拥有丰富的小麦种质资源，对大多数品种所含有的抗病基因缺乏了解，严重限制了我国小麦抗病遗传育种工作的发展。因此，深入研究小麦与叶锈菌互作机制，对于培育抗病品种、提高小麦产量和品质具有重要意义。

1.2DNA甲基化与MSAP技术

DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，是在DNA甲基转移酶的作用下，将甲基基团添加到特定的DNA区域（如CpG岛）的过程。这种修饰方式能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现，在调节植物基因表达、生长发育和抵御逆境等方面起着重要作用。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。在植物应对生物胁迫过程中，DNA甲基化参与调控植物抗病相关基因的表达，影响植物对病原菌的抗性反应。

甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术是在扩增片段长度多态性（AFLP）技术的基础上发展而来的，是一种基于PCR检测DNA甲基化状态的技术。其基本原理是利用对DNA甲基化敏感程度不同的同裂酶（如HpaII和MspI，它们识别相同的CCGG序列，但对甲基化的敏感性不同）与另一种限制性内切酶（如EcoRI）对基因组DNA进行双酶切，然后连接相应的接头，进行预扩增和选择性扩增，扩增产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，最后采用银染或同位素放射自显影方法处理序列胶，统计和分析DNA条带，从而检测基因组DNA在CCGG位点的甲基化状态。

MSAP技术具有诸多优点，如不需要知道被测DNA的序列信息，在不同生物上具有通用性，可用于DNA序列背景知识未知的生物；操作相对简便，在AFLP技术体系的基础上无需改进即可操作；可在全基因组范围检测CCGG位点的胞嘧啶甲基化变化。因此，该技术被广泛应用于植物种质资源鉴定、植物改良、种群遗传结构分析及植物进化研究等遗传学各个领域，在研究植物与病原菌互作过程中DNA甲基化变化方面也发挥了重要作用。

1.3研究目的与意义

本研究旨在利用MSAP技术分析小麦与叶锈菌互作前后基因组DNA甲基化水平和模式的变化，筛选出与小麦抗叶锈病相关的差异甲基化片段，进一步揭示小麦与叶锈菌互作的分子机制，为小麦抗病育种提供理论依据和基因资源。通过深入了解小麦在受到叶锈菌侵染时DNA甲基化的动态变化，有望发现新的抗病相关基因或调控元件，为培育具有持久抗性的小麦新品种提供新的思路和方法，对于保障我国小麦安全生产、提高粮食产量和质量具有重要的现实意义。

二、材料与方法

2.1实验材料

2.1.1小麦材料

选用小麦抗叶锈病近等基因系TcLr1、TcLr35、TcLr44等，以及感病亲本Thatcher。其中，TcLr1对叶锈菌小种具有特定抗性，其抗性基因Lr1可有效抵御部分叶锈菌生理小种的侵染；TcLr35携带的抗性基因能对多种叶锈菌表现出良好抗性，在抗病机制研究中具有重要价值；TcLr44具有持久抗病性，对不同流行小种均有一定抗性，是研究小麦持久抗病机制的理想材料。感病亲本Thatcher对叶锈菌几乎没有抗性，在接种叶锈菌后会迅速发病，出现典型的叶锈病症状，常作为对照材料用于小麦抗叶锈病研究。这些小麦材料均由[提供单位]提供，种子保存于[保存地点]，在实验前经过严格的纯度和发芽率检测，确保实验材料的质量和一致性。

2.1.2叶锈菌材料

所用叶锈菌生理小种为PHTT、THTT等，这些生理小种是根据前期对我国小麦叶锈菌生理小种的监测和分析，筛选出的具有代表性和较强致病性的小种。其中PHTT小种在[地区]广泛分布，能够克服多种小麦品种的抗性，对小麦生产造成严重威胁；THTT小种是我国多个麦区的优势小种，具有较高的毒性频率，能侵染多数感病小麦品种。叶锈菌材料采自[采集地点]的自然发病小麦叶片，经单孢子堆