第四章蛋白质的稳定性.pptVIP

3、二硫交换或巯基氧化。随着冷冻进行，酶浓度增加，半胱氨酸浓度也增加。当这种浓缩效应与构象变化同时发生时，分子内和分子间的二硫交换反应就很容易发生，巯基在低温下更易氧化，因为在-3℃部分冻结系统内的氧浓度要比0℃溶液中的高1150倍。这种浓缩效应还能增加氧自由基的浓度。第28页，共52页。十一、辐射作用1、不同的电离辐射（如γ-射线，X-射线，电子，α-粒子）对蛋白质分子及其周围水分子产生的化学变化类型是相似的。1）直接作用（辐射对蛋白质分子的影响）引起，电离辐射的直接作用由于形成自由基而引起一级结构的共价改变，继而交联或氨基酸破坏。2）间接作用（水辐射分解副产物对蛋白质分子的影响）引起，是由于在水溶液中形成反应性产物，其中主要是·OH(羟自由基)，溶解的电子和H2O2等。第29页，共52页。2、非电离辐射，如可见光或UV辐射也能使蛋白质失活。可见光的光化学氧化要求光敏化染料，它能吸收光能，然后氧化蛋白分子中的敏感基团（半胱氨基，色氨酸，组氨酸）。UV辐射能直接破坏蛋白质的氨基酸而使蛋白质失活；胱氨酸和色氨酸残基特别不稳定。第30页，共52页。第三节蛋白质的稳定化第31页，共52页。酶稳定化方法概述

第32页，共52页。表4-4酶稳定化方法概述?方法说明固定化?1、酶多点连接于载体上酶构象坚固化；立体障碍防止蛋白水解酶的降解作用2、分配效应和扩散限制载体的化学和物理性质影响酶分子周围的微环境非共价修饰?1、添加剂专一性添加剂使N≒U平衡向N移动；竞争性添加剂除掉破坏性催化剂；有的中性盐和多羟基化合物的保护作用2、反相胶团反相胶团中酶抵抗有机溶剂变性3、蛋白质间相互作用酶的抗体保护酶化学修饰?1、共价交联使酶构象坚固化2、改变离子状态或引入立体障碍的试剂修饰增加、中和或改变酶分子上的带电残基；可溶性大分子的连结抑制与其它溶质（蛋白酶）的相互作用蛋白质工程定点突变取代不稳定的氨基酸残基，引入稳定酶的因素第33页，共52页。一、固定化1、酶固定到载体上后可产生空间障碍，结果，其它大分子难于与酶作用。因此，固定到载体上的酶往往能抵抗蛋白水解酶的降解作用，这也是防止蛋白水解酶自溶的原因。固定化也能抑制化学失活，因为载体阻挡酶不能与失活剂接触。2、底物，配体和氢离子浓度在载体附近和整体溶液之间的分布不均一。视底物和载体的性质（带电、疏水性等），其在载体周围的局部浓度与整体溶液不同，也就是说，酶的微环境有了改变。因此，与游离酶相比常可看到固定化酶的最适pH，底物专一性和动力学常数发生改变。例如，用阳离子交换剂和阴离子交换剂作载体固定的酶，其最适pH分别向高pH和低pH值移动。第34页，共52页。3、当酶包埋在多孔颗粒内，底物必须先扩散到颗粒表面（外部质量传递），然后进入颗粒内部（内部质量传递），酶才能与其作用。这些扩散限制可明显使固定化酶“稳定化”。外扩散：底物必须从流动的水溶液传递到固定化酶颗粒外表面，这一过程叫外扩散内扩散：底物进一步传递到固定化酶颗粒内部，这一过程叫内扩散第35页，共52页。4．将酶多点共价连接到载体表面，或用双功能试剂交联酶，或将酶包埋在载体紧密的孔中，可以使酶构象更加坚牢，从而阻止酶构象从折叠态向伸展态过渡图4-8多点固定酶结构示意图：（A）用双功能试剂交联；（B）共价或非共价连于载体上；（C）包埋到载体的紧密孔中。?第36页，共52页。二、非共价修饰

1．反相胶团反相胶团是由两性化合物在占优势的有机相中形成的。反相胶团不仅可以保护酶，还能提高酶活力，改变酶的专一性。在保证酶有效作用所必需的水量的前提下，酶在有机溶剂中的稳定性比在水中更好。例如，在干燥的三丁酸甘油酯中的脂肪酶相当稳定，100℃时的半衰期大于12h,而水含量大于1%时，酶立即失活。图4-12反相胶团示意图第37页，共52页。第1页，共52页。2、蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用在体内，蛋白质常与脂类或多糖相互作用，形成复合物，从而显著增加蛋白质稳定性。当蛋白质形成复合物时，脂分子或蛋白质分子稳定到疏水簇上，因而防止疏水簇与溶剂的接触，屏蔽了蛋白质表面的疏水区域，从而显著增加蛋白质稳定性第2页，共52页。3、盐桥和氢键蛋白质中盐桥的数目较少，但对蛋白质稳定性贡献很显著。嗜热脱氢酶亚基间区域有盐桥协作系统，这是嗜温脱氢酶没有的。因此嗜热酶的催化活力的变性温度和最适温度都比嗜温酶高出约20℃。用定点突变法定性定量地测定了