蛋白质分子量测定方法研究进展讲课文档.pptVIP

蛋白质分子量测定方法研究进展第1页，共22页。SDS凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳技术是实验室进行蛋白质研究中最常用的技术，兼有电泳和分子筛的双重作用。SDS是一种阴离子去污剂，可使蛋白质变性，与其蛋白质结合成带负电荷的蛋白质-SDS复合体，消除电泳过程中蛋白质所带电荷对电泳结果的影响，从而保证蛋白质电泳仅受分子质量大小的影响。在一定的电场作用下，该复合体沿着以聚丙烯酰胺凝胶形成的分子筛向电场的正极移动，从而将蛋白质根据他们的分子量大小而分开。蛋白质-SDS复合体：形状一定、电荷密度一定第2页，共22页。SDS凝胶电泳上样：防止样品溢出、正负极、电压第3页，共22页。SDS凝胶电泳当蛋白质分子量在10-200kDa时，样品的迁移率和分子量的对数呈对数关系，符合如下方程式：lgMW=-b﹒Rf+K其中，MW为蛋白质分子质量，Rf为相对迁移率，b为斜率，K为截距，当条件一定时，b和K为常数。因此通过已知分子量的蛋白和未知分子量蛋白的比较，就能得出未知蛋白的分子量。第4页，共22页。影响分子量测定的因素很多，包括蛋白质与SDS的结合量的不同，凝胶浓度和交联剂浓度等，如图所示。研究者测定了当交联剂浓度不变，改变凝胶浓度，下图分别对应于凝胶浓度为5%，10%，15%。SDS凝胶电泳第5页，共22页。优点：操作简单，容易掌握，成本低，分辨率高，重复效果好。缺点：对于电荷异常或者构象异常的蛋白、带有较大辅基的蛋白及一些结构蛋白测定的分子质量不太可靠，而且电泳结束后还需要染色，染色，脱色比较耗时。SDS凝胶电泳第6页，共22页。凝胶渗透层析法定义：又叫体积排阻层析、分子筛层析，当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行的分离技术。固定相：惰性凝胶颗粒，颗粒内部立体网状结构，形成许多孔穴原理：第7页，共22页。凝胶渗透层析法常用凝胶：交联葡聚糖凝胶（Sephadex）、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶（Sepharose）第8页，共22页。凝胶渗透层析法洗脱体积Ve与分子量的关系可用下式表示：Ve=K1—K2logMW（K1、K2为常数，MW为分子量）从公式可以看出，目标样品的流出体积与分子量对数成线性关系。在实际操作过程中，选取标准品与样品同时通过凝胶柱，通过已知标准品的流出体积和分子量可以计算出曲线中的K1、K2值，再根据已知的曲线方程和样品流出体积计算样品的分子量。第9页，共22页。凝胶渗透层析法优点：操作简单，设备简单，样品用量少，周期简单，条件温和，一般不引起生物活性的改变。缺点：应用具有一定的局限性，在pH6—8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。第10页，共22页。质谱法1906年，Thomson发明了质谱技术，最初只是用于无机化学中的同位素分析，直至20世纪40年代末才发展成为有机质谱。近年来，生物质谱技术取得了突飞猛进的发展，其中以分别由美国科学家和日本科学家田中耕一发明的电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）及基质辅助激光解吸电离质谱技术（MALDI-MS）的贡献最为突出。可准确测定分子量第11页，共22页。

1.电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）原理：电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷密度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相的质谱技术。ESI-MS测定蛋白质大分子是根据一簇多电荷的质谱峰群，通过解卷积的方式计算得到蛋白质的分子量，由于ESI-MS可以产生多电荷峰，因此使得测试的分子质量范围大大扩大。第12页，共22页。

1.电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）电喷雾是一种离子化方法，可以用作质谱仪的离子源第13页，共22页。

1.电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）多电荷使得样品谱图复杂荷质比：第14页，共22页。

1.电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）优点：（1）对样品的消耗少，不会造成样品的大量浪费；（2）对样品分子质量测试灵敏度、分辨力和准确度都相当高；（3）能够方便地与多种分离技术联用，如毛细管电泳、高效液相色谱等，是解决非挥发性、热不稳定性、极性强的复杂组分化合物的定性定量的高灵敏度检测方法。缺点：对样品纯度要求高，且会形成多电荷的质谱峰群，难以分辨，使得结果分析较为困难。第15页，共22页。

2.基质辅助激光解吸电离质谱技术（M