复旦大学《生物制药技术》教学-基因工程制药.pdfVIP

基因工程制药

一、概述

基因工程g（eneengineering）

又称基因拼接技术和DNA重组技术，是分子遗传学为理论基础，分子生物学和微生

物学的现代方法为手段，将不同来源的基因D（NA分子），按预先设计的蓝图，在体外构建杂

种DNA分子，然后导入活细胞，改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。

技术上三大发明

1、限制性内切酶和连接酶的发现

2、载体V（ector）的发现：载体相当于运送重组DNA分子到宿主细胞的车子

3、逆转录酶的发现，打破了中心法则，使真核基因的制备成为可能

二、基因工程的酶和载体英（文和作用）

1、工具酶重（点）

a.限制性内切酶r（estrictionendonuclease）

定义：能够识别双链DNA分子上特定核昔酸序列，并进行切割的水解酶

主要存在于原核生物中

生理功能：构成了细胞抵御外源入侵DNA的防御机制

提供了细菌种属间进行交叉繁殖的屏障，但又允许外源DNA有某些遗漏

分类：I型、II型、III型

II型限制性内切酶

i）异源同工酶：来源不同，识别顺序相同的酶，切割位点不同，产生平头或粘性末端。

ii）同尾酶：来源及识别序列不相同，切割后产生相同的粘性片段。

b.DNA连接酶

定义：催化两条分别具有5-磷酰基末端与3-羟基末端的DNA单链连接形成磷酸二酯键

的酶。

常用连接酶：

i）T4DNA连接酶：可连接粘性及平头末端

ii）大肠杆菌DNA连接酶：只能连接粘性末端

c.DNA多聚酶

i）聚合酶

功能：DNA或RNA为模板，催化DNA和RNA的体外合成。

特点：需要引物和模板；

不能起始新的DNA链，而是催化dNTP连续加到双链DNA分子引物链30H端

不发生从引物模板上解离

*例:大肠杆菌DNA聚合酶IE（.coliPolymeraseI）

小片段:5-3聚合酶活性

大片段K（lenow片段）：双链特异性的5-3外切酶活性；单链特异性的3-5外切酶

活性

Klenow片段基本用途：补平由核酸内切酶产生的3粘性末端；DNA片段的同位素末端标记

ii）TaDNA聚合酶

功能：耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶。在模版及引物存在的条件下，催化与模版互补的脱

氧核甘酸一次选择性地连接在引物的3011末端上的反应。

特点：

末端A,即粘性末端，

5-3外切核酸酶活性

有链置换的能力。

无3-5外切核酸酶活性，无校对功能，易突变。

Mg2+依赖酶

用途：

DNA序列分析；

应用于聚合酶链反应P（CR），对DNA分子的特定序列体外扩增产（物为粘末端）；

iii）逆转录酶r（eversetranscriptase）

功能：依赖于RNA的DNA聚合酶，又称RNA依赖的DNA聚合酶。有效的转录mRNA成为cDNA,

是一个多功能酶。

iv）末端脱氧核甘酸转移酶T（erminalDeoxynucleotidaylTransferase）

功能：在二价阳离子存在下，催化dNTP沿5-3方向聚合作用逐个顺序加于线性DNA分

子的30H末端。

2、载体V（ector）

概念:凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以供插入或克隆目的基因并具有传递运载外源

DNA导入宿主细胞能力的DNA片段称为载体。

功能及特征:

运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因的扩增

或表达提供必要的条件。

应具备的条件:

•具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）

•具有合适的筛选标记

•具有较高的外源DNA的载装能力

•具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点

•具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点

质粒(plasmid)

定义:生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。

分子构型:线性(sscDNA)、环状(OCDNA),超螺旋

特性:

•质粒的自主复制性

­质粒具有不相容性

­质粒具有遗传传递和遗传交换的能力。

•携带特殊的遗传标记

优点:分子量小易