基因工程课件章.pptVIP

PCR原理示意图第29页，共53页，星期日，2025年，2月5日2.PCR产物的鉴定1)PCR产物的大小和限制酶谱分析2)寡聚核苷酸限制性内切酶片段分析（OR分析，OligomerRestrictionanalysis）OR分析对于PCR产物的限制酶位点上发生了点突变的检测极其有用第30页，共53页，星期日，2025年，2月5日PCR产物的OR鉴定第31页，共53页，星期日，2025年，2月5日3)分子杂交适合于检测PCR产物的非限制酶位点上碱基突变。它是利用两条引物链间的特异性DNA片段作探针(常为人工合成的一段低聚核苷酸，约20n.t.).当这种探针的核苷酸序列与待测的DNA核苷酸序列完全互补时才能杂交。如果利用多种等位基因特异性寡核苷酸探针（allele-specificOligonucleotide,ASO）与PCR产物进行杂交，可检测出PCR产物的碱基突变。可直接利用斑点杂交方法用于基因型分析第32页，共53页，星期日，2025年，2月5日4)核苷酸序列分析???????????DNA扩增产物变性与末端标记的扩增引物或定序引物退火双脱氧核苷酸链终止反应，测定DNA序列第33页，共53页，星期日，2025年，2月5日二．TaqDNA聚合酶的特点TaqDNA聚合酶是从一种极度嗜热水生栖热菌YT-1中分离纯化而得。该酶的分子量为63-68kD1.无磷酸单酯酶、磷酸二酯酶以及单链外切酶活性，无内切酶活性，但具有依赖于聚合酶活性的5’3’外切酶活性2.最适反应温度为80℃3.最适pH8.0和最佳反缓冲液Tris·HCl4.最佳二价阳离子Mg2+（10mM）5.具良好的热稳定性：在90℃下连续反应30分钟仍有70%的酶活第34页，共53页，星期日，2025年，2月5日TaqDNA聚合酶的特性第35页，共53页，星期日，2025年，2月5日当采用TaqDNA聚合酶进行DNA体外扩增时，必须考虑到以下五个参数：1）热稳定性：在PCR循环中DNA的变性时间常为30-60″，若循环30次，其累计加热变性时间为15-30′。TaqDNA聚合酶在90℃下保温30′仍具有70%酶活性，可大大减少操作步骤，易于实现自动化*2）模板与引物的特异性：当退火温度和DNA链延伸时温度偏低时，引物与模板配对的特异性大大降低，从而导致一些不需要的DNA片段被扩增。显然，其产物的专一性大大降低，使结果无法分析。由于TaqDNA聚合酶最适反应温度为80℃，退火温度可提高到55℃以上，由此大大减少了引物与模板的非专一性结合，使产物均一性大大增加**3）合成产率：反应底物和产物在DNA扩增中不断发生变化，最终将会导致聚合反应进入平台期，平台期出现的时间与聚合酶的特性有关。研究表明，利用Klenow片段进行20次扩增后进入平台期，累积产物拷贝数为2×105，当采用TaqDNA聚合酶时，扩增25次后才进入平台期，拷贝数可大4×106***4）延伸长度：有时为了获取较长DNA片段的扩增，这就要求DNA聚合酶具有较强的延伸能力。当扩增片段大于250bp时，Klenow片段和T4聚合酶扩增产率大大降低。利用T7DNA聚合酶，可使扩增片段达2Kb。当利用TaqDNA聚合酶时，最长延伸长度为4.4Kb.第36页，共53页，星期日，2025年，2月5日经改造的TaqDNA聚合酶可扩增出40kb的DNA片段.5）扩增产物的可靠性：评估DNA聚合酶的一个重要指标是它复制DNA的可靠性，即掺入错误碱基的频率。这对于PCR技术的可靠性是至关重要的。Klenow片段的错误掺入率为10-4，TaqDNA聚合酶的错误掺入率为5×10-3，而T4聚合酶的错误掺入率为10-7。?*注：1）退火温度常与引物的长度和碱基组成有直接相关关系，引物越长或GC含量较高，退火的温度可以高些，反之则低些。退火温度越高，引物与模板（即扩增的DNA）结合的特异性越高，这可大大减少非特异性DNA片段的扩增。引物的长度常为20-28聚体，其中有50%以上的GC含量，无自身互补序列，特别是3末端不应有内部二级结构，引物加量为每100μll20pmol.**2)出现平台期的原因可能有：①后期循环酶浓度或聚合时间不足；②引物耗尽；③dNTP耗尽；④产物浓度过高，以致ds-DNA解链后又迅速退火，不能与引物结合。***3）链延伸长度与延伸时