蛋白质纯化色谱技术.ppt

MiniQPC3.2/3:GlutathionesynthetaseSDSStartingmaterialPeak2第60页，共92页，星期日，2025年，2月5日第61页，共92页，星期日，2025年，2月5日常见问题分析不吸附：缓冲溶液PH不对；离子强度太高；峰形不稳或出现奇异峰：柱床中有气泡或缓冲溶液不纯分辨率低：梯度太大；流速太高前沿峰：柱过载；填充效果差；柱需再生峰拖尾：样品在柱滤膜上或凝胶床顶部沉淀第62页，共92页，星期日，2025年，2月5日四、疏水性相互作用色谱

(HydrophobicInteractionChromatography）Hydrophobicinteractionchromatographyisaliquidchromatographytechniquethatseparatesbiomoleculesaccordingtotheirhydrophobicity＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－－－－－－－－－－－－－－蛋白质表面电荷疏水区域分布示意图“盐促吸附层析”

在适当高盐浓度下，蛋白质的疏水残基与固定相上的疏水配基产生吸附作用。第63页，共92页，星期日，2025年，2月5日第64页，共92页，星期日，2025年，2月5日MechanismofHIC第65页，共92页，星期日，2025年，2月5日A2800.04AUNa2SO41.0M疏水色谱操作第66页，共92页，星期日，2025年，2月5日疏水色谱特点特点：它分离效率高，上样量大，特别适合分离盐析沉淀的样品。填料：烷基琼脂糖凝胶、苯基琼脂糖凝胶，丁基琼脂糖凝胶，辛基琼脂糖凝胶等。第67页，共92页，星期日，2025年，2月5日疏水层析VS反相色谱同：分离介质（固定相）吸附原理异：作用强弱用途第68页，共92页，星期日，2025年，2月5日五、反相色谱原理：是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子迁移速度快而先被洗脱下来。一般使用甲醇、乙腈作流动相，使得蛋白质容易变性失活；常用于HPLC分析，与在水-有机相中稳定的多肽和低分子量蛋白质的分离。第69页，共92页，星期日，2025年，2月5日反相液相色谱反相液相色谱分离多肽和蛋白质使基于蛋白质的疏水性，因此通常采用非极性的烷基固定相作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应最大限度地满足疏水的要求通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸）来增大蛋白质和多肽的疏水性第70页，共92页，星期日，2025年，2月5日载体：微粒多孔硅胶（粒径5μm~20μm）HypersilSpherosilXOB075固定相：C18、C8烷基链，C8适于分离蛋白质C18适于分离核酸苯基流动相的选择通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和四氢呋喃第71页，共92页，星期日，2025年，2月5日SourceRPC第72页，共92页，星期日，2025年，2月5日30μm15μm5μmInfluenceofParticleSizeontheSeparationeffect第73页，共92页，星期日，2025年，2月5日六、亲和色谱

（Affinitychromatography）载体活化、配基连接、吸附、洗脱第74页，共92页，星期日，2025年，2月5日保留时间（tR）和保留体积（VR）反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一第28页，共92页，星期日，2025年，2月5日阻滞因子Rf阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相Kd=0）的迁移率之比其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小第29页，共92页，星期日，2025年，2月5日理论塔板数蛋白质实验技术－层析纯化numberoftheoreticalplates色谱的柱效参数,用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。第30页，共92页，星期日，2025年，2月5日色谱柱的理论塔板数、塔板高度反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离