腺病毒中文操作手册.docVIP

腺病毒载体操作手册中文版

腺病毒重组系统

AdEasyTM操作手册?目录

第一章简介1

第二章应用重组腺病毒的优点2?第三章ＡdEasyTM技术３

3。1技术概况3?3。２AdEasｙTM系统中产生重组腺病毒的时程3

第四章主要流程４

4.１将基因克隆入AdＥasyTM转移载体４

?4。1.１克隆的一般原则4??４。1.2构建重组ＡdEasyTM转移载体5

４。２细菌内AｄEａｓyTＭ重组子的产生５

?４.2。１共转化的一般原则5??４。2.2共转化方法5??4.2。3预期结果５

4。３AdEａsyTM重组质粒的筛选和扩增６

4.4ＡdEasyTM重组子转染QBI—29３Ａ细胞6

?4。４.1细胞铺板6

?４。4.2磷酸钙转化技术7?第五章常用技术8

５。1ＱBI－2９3A细胞培养8

?5.1.1QＢI-2９３A细胞的初始培养８

?5。1.2QBI—293A细胞的维持培养和增殖8??5。１.3ＱＢI—2９3A细胞的冻存8?5．2QBI—29３Ａ细胞的转染和病毒空斑的产生9

?5。2.1感染QBI-293A细胞９??5.２。2病毒空斑形成９

?５。2．3琼脂糖覆盖被感染细胞９?5.3ＭＯＩ测定10?5。４腺病毒感染力测定10??5．４。1X—Ｇal染色11?5。5重组腺病毒的筛选和纯化11

?5.5。1挑选最佳重组腺病毒:表达和基因输送1１

?5。5。2病毒空斑挑选和小量扩增１2??5。5。3Weｓterｎ杂交13

?5。５。4Soｕtｈern杂交和点杂交１3

?5.5。５病毒裂解产物PCＲ14??5。5。6免疫测定14

?５。５。7功能测定１4?５.6病毒颗粒在ＱBI-293A细胞中的大量扩增15

５。7两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒１6

?5。7.１不连续密度梯度离心１7

?5。7。２连续密度梯度离心1７??5。7。3病毒溶液去盐和浓集1７

5。8病毒滴度测定１8??5.8.1O。D。260nm（ＶP／ｍl)１9

?5．8．2空斑测定法20

?5.8.３50％组织培养感染剂量法20

第六章疑难解答2２

6。１ＱＢＩ-293A细胞培养2２

6.2感染力测定22?6。3转移载体克隆２３?6.4在BＪ5１8３细胞中共转化和重组24?6。５转染ＱBI-2９３A细胞２５

6。6筛选和测定25?6。7在QＢＩ—２９3A细胞中表达26

6。8重组腺病毒的扩增26?6.9纯化2６?6。10病毒滴度测定27

缩写英文全称中文全称

AdAｄenoｖirus腺病毒?Ad５Ａdeｎｏvirｕssｅroｔypｅ5血清5型腺病毒

AdVAｄenoviｒalVｅctor腺病毒载体

AmpＡmpicｉllin氨苄青霉素

β—Ｇａlβ-Gａlａcｔｏsｉdaseβ—半乳糖苷酶?bpBasePair碱基对?ＢSＡＢovineＳeｒｕmAlｂｕmiｎ小牛血清白蛋白

ｃＤNＡＣomplementａｒyDNA互补DNＡ?cccDＮAＣlｏsedCｉｒcｕlarCoｉledDＮA闭环螺旋ＤNＡ?CPECyｔoｐatｈicEffect细胞病理效应?CｓClCｅsｉumChloriｄe氯化铯?DＭＥＭＤulbeｃco’ｓMｏdｉｆieｄＥａｇｌeMeｄiumDMEM培养基

ＤMSＯＤimethyｌSulｆoxide二甲基亚砜

DTTＤithioｔhreitol二硫苏糖醇?ＥDTAＥthyｌeneDｉamｉneTetrａaceｔiｃＡｃid乙二胺四乙酸

EtＢｒＥtｈidｉumBｒomｉde溴化乙锭

FBＳFｅtalBoviｎeSeruｍ胎牛血清?ＨrHouｒ小时

ITＲInvertｅdＴerminalＲｅpｅaｔ反向末端重复

ＫanKanamycｉｎ卡那霉素?ｋbKｉloｂases千碱基对

ＫDaKｉlｏDａlｔons千道尔顿

ＬBLｕrｉａ—Bｅrtaｎi（broth)LB培养基?MＣSMultiｐleCｌoningＳｉte多克隆位点

ＭinMiｎutｅ分钟

MOIＭultiplicｉｔｙoｆInｆｅｃtion(Ｖirｕs/Cell）感染复数?ｍRＮＡMesｓｅngｅｒRＮＡ信使RNA?MWCOMOIｅculａrＷｅiｇｈtCut—ｏff

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