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茎瘤芥高效再生体系与遗传转化体系构建及应用研究

一、引言

1.1研究背景

茎瘤芥（BrassicajunceaCoss.var.tumidaTsenetLee），又名青菜头、菜头，隶属十字花科芸薹属，是一类重要的蔬菜。其以瘤状膨大茎供食用，加工成品即为闻名遐迩的榨菜。茎瘤芥不仅是备受青睐的鲜食蔬菜，更是重要的腌制加工蔬菜，加工产品历史悠久、风味别具一格，在国内外市场均十分畅销。全国茎瘤芥种植面积约20万hm2，主要分布于重庆、浙江、四川、湖南、湖北等省市，其中重庆的种植和加工规模独占鳌头。2016年，重庆市茎瘤芥种植面积达10.7万hm2，产量280万t，综合产值95亿元。重庆加工的榨菜形成了陶坛装、塑料袋装、玻璃听装三大包装的涪陵青菜头、全形榨菜、方便榨菜、出口榨菜四大系列产品，共计200余个品牌，产品畅销全国各地，并出口至东南亚、欧美等50多个国家和地区。

随着人们生活水平的提高和对蔬菜品质要求的日益增加，对茎瘤芥进行深入的研究和改良显得愈发重要。传统的育种方法在一定程度上推动了茎瘤芥品种的更新换代，但存在周期长、效率低等局限性。现代生物技术的飞速发展，为茎瘤芥的遗传改良提供了新的契机。建立高效的再生体系和遗传转化体系，能够为茎瘤芥的基因功能研究、分子育种等提供坚实的技术支撑，有助于加快优良品种的选育进程，提高茎瘤芥的产量、品质和抗逆性，从而更好地满足市场需求，推动茎瘤芥产业的可持续发展。

1.2研究目的和意义

本研究旨在通过对茎瘤芥再生体系和遗传转化体系的优化，建立高效、稳定的技术体系。具体而言，筛选出适合茎瘤芥组织培养的外植体和培养基配方，确定最佳的培养条件，提高再生频率；探索适合茎瘤芥遗传转化的方法和条件，优化转化参数，提高转化效率，为茎瘤芥的基因工程改良奠定基础。

从理论层面来看，高效再生体系和遗传转化体系的建立，有助于深入探究茎瘤芥的生长发育机制、基因表达调控等基础生物学问题，丰富十字花科植物的遗传学理论。从实践意义上讲，该技术体系的建立，能够为茎瘤芥的分子育种提供有力工具，加速优良性状基因的导入和新品种的培育，提高茎瘤芥的产量和品质，增强其抗病虫害和抗逆能力，降低生产成本，提高经济效益；同时，有助于保护和利用茎瘤芥的种质资源，创新种质材料，推动茎瘤芥产业的健康、稳定发展。

1.3国内外研究现状

在茎瘤芥再生体系研究方面，国内外学者已取得一定成果。国内研究发现，茎瘤芥的子叶、下胚轴等外植体在添加不同植物生长调节剂的MS培养基上，能够诱导出愈伤组织并分化出不定芽。例如，有研究表明茎瘤芥的子叶培养在加有不同浓度NAA、BA和2,4-D的MS培养基上可以诱导出具有不同特性的愈伤组织，其中以MS+0.25mg?L?1NAA+0.25mg?L?12,4-D+0.5mg?L?1BA的配比获得的愈伤组织性状最佳。茎瘤芥的子叶块培养在MS+1.0-5.0mg?L?1BA+0.05mg?L?1NAA的培养基上可以直接诱导出不定芽，其中在MS+3.0mg?L?1BA+0.05mg?L?1NAA培养基上的再生频率最高且每块子叶再生的平均芽数也最多。国外研究也关注到不同培养条件对茎瘤芥再生的影响，但在研究深度和广度上与国内存在一定差异。

在遗传转化体系研究方面，农杆菌介导法是常用的转化方法。国内通过正交试验法研究了茎瘤芥遗传转化过程中预培养时间、共培养时间、侵染液浓度、侵染时间等因素对转化率的影响，发现最适合茎瘤芥CRY2基因RNAi载体遗传转化的条件为预培养3d、共培养4d、侵染液浓度OD600=0.5、侵染10min，此时Kana选择压为30mg/L，遗传转化率有较大提高。国外也有类似研究，但在转化基因的选择和转化体系的优化方向上与国内有所不同。

然而，目前茎瘤芥的再生体系和遗传转化体系仍存在一些不足。再生体系方面，再生频率和再生植株的质量有待进一步提高，不同基因型茎瘤芥的再生能力差异较大，限制了该技术的广泛应用；遗传转化体系方面，转化效率较低，转化过程对受体材料的伤害较大，且转化后的植株容易出现基因沉默等问题，影响了转基因植株的获得和应用。

二、茎瘤芥高效再生体系研究

2.1实验材料与方法

2.1.1实验材料

本研究选用的茎瘤芥品种为“永安小叶”，该品种是茎瘤芥的典型代表，具有生长势强、适应性广、瘤茎品质优良等特点，由重庆市渝东南农业科学院提供。种子经过严格筛选，确保颗粒饱满、无病虫害。

实验所需的各类试剂均为分析纯，包括MS（MurashigeandSkoog）培养基的各种成分，如大量元素、微量元素、铁盐、有机成分等，购自Sigma公司；植物激素如6-苄基腺嘌呤（