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免疫学做法操作规程

一、概述

免疫学做法操作规程是指在免疫学实验或临床检测中，为确保结果准确性、操作安全及标准化而制定的一系列标准化流程。本规程涵盖了从样本准备、试剂配制、实验操作到结果判读等关键环节，旨在规范免疫学相关工作的开展，提高实验效率与数据可靠性。

二、操作准备

（一）环境要求

1.实验室环境应保持洁净，温度控制在22±2℃，湿度维持在50±10%。

2.操作区域需配备生物安全柜，确保无菌操作。

3.使用一次性耗材以避免交叉污染。

（二）试剂与材料

1.试剂配制：

(1)免疫荧光染色液需使用预稀释液，避免直接配比。

(2)ELISA试剂盒需在4℃保存，使用前需平衡至室温。

2.材料准备：

(1)移液器枪头需经高压灭菌处理。

(2)微孔板需使用酶标板清洗液进行清洗。

三、样本处理

（一）样本采集

1.血清样本：采集后立即离心（3000rpm，5min），取上清液分装保存。

2.组织样本：新鲜组织需用4%多聚甲醛固定，24小时后梯度脱水。

（二）样本前处理

1.DNA提取：

(1)使用商业化DNA提取试剂盒，严格按说明书操作。

(2)检测DNA浓度（使用核酸蛋白仪，参考值≥200ng/μL）。

2.蛋白质提取：

(1)加入RIPA裂解液，冰上孵育30min。

(2)离心（12000rpm，4℃，20min），取上清液。

四、实验操作

（一）免疫荧光染色

1.固定：样本用4%多聚甲醛固定20min，PBS清洗3次。

2.封闭：用5%羊血清封闭1h，避光保存。

3.一抗孵育：4℃过夜，次日复温至室温。

4.二抗孵育：室温孵育1h，避光保存。

5.显色：滴加DAPI复染5min，封片剂封片。

（二）ELISA检测

1.样本加样：每孔加入100μL样本，设空白孔、标准孔。

2.一抗孵育：4℃过夜，次日复温。

3.二抗孵育：37℃孵育1h，TBS清洗3次。

4.底物显色：加入TMB显色液，避光反应30min。

5.终止反应：加入2MH?SO?终止，酶标仪检测（450nm波长）。

五、结果判读

（一）免疫荧光结果

1.使用荧光显微镜观察，阳性细胞呈现黄绿色荧光。

2.计数500个细胞，计算阳性率（参考值30%-50%）。

（二）ELISA结果

1.根据标准曲线计算样本浓度（参考范围0.1-10ng/mL）。

2.异常值需重复检测，确认实验准确性。

六、注意事项

1.所有操作需佩戴手套，避免手部污染。

2.实验结束后，废弃物需按生物危害物处理。

3.仪器使用后需及时校准，确保数据可靠性。

**一、概述**

免疫学做法操作规程是指在免疫学实验或临床检测中，为确保结果准确性、操作安全及标准化而制定的一系列标准化流程。本规程涵盖了从样本准备、试剂配制、实验操作到结果判读等关键环节，旨在规范免疫学相关工作的开展，提高实验效率与数据可靠性。其核心目的是通过明确化的步骤和规范化的操作，最大限度地减少人为误差和环境污染，从而获得稳定、可靠的实验结果，为后续的科研分析或临床诊断提供有力支持。本规程适用于细胞免疫学、分子免疫学、血清学等多种免疫学检测技术。

二、操作准备

（一）环境要求

1.实验室环境应保持洁净，温度控制在22±2℃，湿度维持在50±10%。

*具体说明：温度的恒定对于酶促反应、抗原抗体结合等生物过程至关重要，过高或过低的温度都可能影响反应速率和效率。湿度控制则有助于防止试剂蒸发或仪器受潮。

2.操作区域需配备生物安全柜，确保无菌操作。

*具体说明：生物安全柜通过创建负压环境，有效阻止操作过程中产生的气溶胶和微生物向外扩散，保护操作人员及环境安全。使用前需检查紫外灯照射时间、风量等参数是否正常。

3.使用一次性耗材以避免交叉污染。

*具体说明：包括移液器枪头、吸头、离心管、培养皿等，每次实验前后均需彻底更换，并按规定分类废弃物。

（二）试剂与材料

1.试剂配制：

*具体说明：所有试剂配制均需使用符合标准的化学试剂，并精确称量或量取。配制过程需在洁净台或超净工作台中完成，并记录配制日期、浓度、有效期等信息。

*(1)免疫荧光染色液需使用预稀释液，避免直接配比。

*具体说明：预稀释液已根据优化方案配制好特定浓度，直接使用可避免因个体操作差异导致的浓度误差，保证染色效果的一致性。

*(2)ELISA试剂盒需在4℃保存，使用前需平衡至室温。

*具体说明：试剂盒冷藏保存可稳定其活性成分。使用前需在室温下放置足够时间（通常为1-2小时），使其温度与实验环境一致，避免因温差导致加样误差或反应异常。

2.材料准备：

*具体说明：所有材料在使用前需检查其状态是否合格，如是否有破损、过期等。

*(1)移液器枪头需经高压灭菌