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2025第二人民医院原位杂交技术考核及答案

2025年第二人民医院病理科原位杂交技术考核试题及答案

一、理论知识考核（共40分）

1.简述原位杂交技术的基本原理及核心优势。（5分）

答：原位杂交（ISH）是利用核酸分子碱基互补配对原则，将标记的核酸探针与组织、细胞或染色体中的待测核酸（DNA/RNA）在原位进行特异性结合，通过显色或荧光检测系统显示目标核酸的位置、分布及表达量的技术。其核心优势在于：①保持组织细胞形态与核酸分布的空间对应关系；②可同时观察目标分子与组织学特征的关联；③适用于低丰度核酸的检测（如病毒DNA、特定mRNA）；④可实现多色探针共杂交，分析多靶点共定位。

2.按标记物分类，原位杂交探针可分为哪几类？各类探针的适用场景及标记方法是什么？（8分）

答：探针按标记物分为放射性标记探针与非放射性标记探针两类。

（1）放射性标记探针：常用3H、32P、3?S标记，通过放射自显影检测。优势是灵敏度高，适用于低丰度核酸（如细胞因子mRNA）的定量分析；缺点是放射性危害大、检测周期长、分辨率低，临床实验室已较少使用。

（2）非放射性标记探针：包括荧光素（如FITC、Cy3）、半抗原（生物素、地高辛）及酶（HRP、AP）标记探针。荧光素标记探针通过荧光显微镜直接观察，适用于快速检测（如FISH检测染色体易位）；半抗原标记探针需通过偶联酶或荧光分子的抗体/亲和素放大信号，适用于石蜡切片等需信号增强的场景（如HPV-DNA检测）；酶标记探针通过酶促显色反应（如DAB、NBT/BCIP）呈现可见信号，适合普通光学显微镜观察（如EB病毒EBER检测）。

3.石蜡切片原位杂交前处理中，脱蜡与水化的操作要点及意义是什么？若脱蜡不彻底会导致哪些结果？（6分）

答：脱蜡与水化是石蜡切片预处理的关键步骤。操作要点：①脱蜡需用新鲜二甲苯（2次，5min/次），37℃温箱可加速蜡质溶解；②水化按梯度乙醇（100%→95%→85%→75%→蒸馏水）递减，每步3min，避免组织片脱落。

意义：石蜡包埋会覆盖组织内核酸，脱蜡去除石蜡后，水化使组织重新吸水膨胀，暴露核酸结合位点。

若脱蜡不彻底，石蜡残留会阻碍探针渗透，导致杂交信号弱或无；同时可能造成背景不均（蜡质区域无信号，非蜡质区域信号正常）。

4.蛋白酶消化在原位杂交中的作用是什么？如何根据组织类型调整消化条件？（5分）

答：蛋白酶消化（常用蛋白酶K）的作用是降解组织中的蛋白质，破坏核酸与蛋白质的结合（如核蛋白包裹mRNA），使探针更易进入靶核酸区域。消化不足会导致信号弱（核酸未充分暴露），消化过度则破坏组织形态（细胞结构崩解）或导致靶核酸丢失（尤其是RNA）。

调整原则：①致密组织（如肝脏、淋巴结）需增加酶浓度（15-20μg/ml）或延长时间（15-20min）；②脆弱组织（如脑、胚胎）需降低酶浓度（5-10μg/ml）或缩短时间（5-10min）；③RNA原位杂交消化时间应短于DNA（RNA更易降解）；④陈旧标本（固定时间＞48h）因交联更紧密，需适当延长消化时间。

5.杂交液中通常包含哪些成分？各成分的作用是什么？（6分）

答：杂交液核心成分为：①探针（目标核酸互补序列）；②甲酰胺（50-70%）：降低杂交温度（每增加1%甲酰胺，杂交温度降低0.72℃），减少高GC含量探针的非特异性结合；③SSC（2×-6×）：提供Na?中和核酸磷酸骨架负电荷，促进探针与靶核酸结合；④硫酸葡聚糖（5-10%）：通过体积排阻效应提高探针局部浓度，加速杂交；⑤Denhardt’s溶液：含BSA、聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮，减少探针与组织非特异性吸附；⑥鲑鱼精DNA/酵母tRNA（0.1-0.5mg/ml）：封闭组织内非特异性核酸结合位点（如重复序列）。

6.杂交后洗涤的“严谨性”由哪些因素决定？如何通过调整洗涤条件减少非特异性信号？（5分）

答：洗涤严谨性由温度、盐浓度（SSC浓度）、洗涤剂（如SDS）浓度共同决定。温度越高、盐浓度越低、SDS浓度越高，严谨性越强，越易去除非特异性结合的探针。

减少非特异性信号的方法：①提高洗涤温度（比杂交温度低5-10℃）；②降低洗涤液SSC浓度（如从2×SSC降至0.1×SSC）；③添加0.1%SDS破坏蛋白质介导的非特异性结合；④延长洗涤时间（2次，10min/次）。

7.荧光原位杂交（FISH）与显色原位杂交（CISH）的主要区别及各自适用场景是什么？（5分）

答：区别：①检测系统：FISH使用荧光标记探针，直接通过荧光显微镜观察；CISH使用酶标记探针（如HRP/AP），通过显色反应（DAB/快红）显示信号。②分辨率：FISH分辨率高（可区分＜2Mb的基因片段），CI