细胞生物学第章细胞生物学研究方法.pptVIP

本章内容提要;;;;;分辨率;样品的制作;（二）荧光显微镜Fluorescencemicroscope;第九页，共七十九页。;原理:利用一定波长的光,照射被检样品,激发荧光物质发出可见的荧光,视场中所见像主要是样品的荧光映像.

自发荧光:生物体内有些物质受激发光照射后可直接发出的荧光.木质素,叶绿素

次发荧光:标本本身不发荧光，经荧光染料处理后,那些对荧光染料有选择性吸收的部分经激发后发出的荧光.

常用荧光物质：酸性品红，甲基绿，中性红，EB等。;;（三）激光共聚焦扫描显微境

Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM;第十三页，共七十九页。;第十四页，共七十九页。;第十五页，共七十九页。;;第十七页，共七十九页。;相差显微镜的基本原理;（六）微分干涉差显微镜Differentialinterferencecontrastmicroscope（DIC）;;;;1.原理：

以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比。

由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。

分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。

用于观察超微结构（小于0.2μm）。

用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。;;电子显微镜与光学显微镜的基本区别;;;;Page59;Electronmicrographofaroot-tipcellstainedwithosmiumandotherheavymetalions.Thecellwall,nucleus,vacuoles,mitochondria,endoplasmicreticulum,Golgiapparatus,andribosomesareeasilyseen.;负染技术;NegativeStainedActin;冷冻蚀刻freeze-etching;酵

母

细

胞;;;;第三十八页，共七十九页。;第三十九页，共七十九页。;第四十页，共七十九页。;;

原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。

分辨率：横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.001nm。

用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。

;STMimageofaDNAmolecule;第二节细胞组分的分析方法;一、离心技术;1.差速离心Differentialcentrifugation;Lowspeed;2.密度梯度离心;速度沉降velocitysedimentation;等密度沉降isopycnicsedimentation;Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation;二、细胞组分显示方法;

;2.显示方法

金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CuS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。

Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。

联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。

脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。

茚三酮反应：显示蛋白质。;金属沉淀法;E.茚三酮反应：显示蛋白质。;三、特异蛋白抗原的定位和定性;用抗α-tubulin抗体染色显示微管(绿色);细胞核:红色,DAPI染色(激光共聚焦显微镜照片);2.免疫电镜技术Immuneelectronmicroscopy：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等;四、细胞内特异核酸序列的定位与定性;;1.流式细胞技术;第六十三页，共七十九页。;2.显微光谱分析技术;第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术;一、细胞培养;(一)、细胞培养的基本概念;(二)、动物细胞培养;永生细胞系(infinitecellline)

细胞发生遗传突变，并带有癌细胞的特点，可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称为永生细胞系。

如：HeLa细胞系、BHK21细胞系、Vero细胞系、CHO细胞系

细胞株：具有特殊遗传标记或性质的细胞群体。

;（二）动物细胞培养;原

代

培

养;（二）植物细胞培养;第七十三页，共七十九页。;(四)非细胞体系在细