基于未纯化蛋白配体-靶标对识别方法研究.pdfVIP

IdentificationofLigand−TargetPairsfromCombinedLibrariesofSmallMolecuand

UnpurifiedProteinTargetsinCellLysates

：JOURNALOFTHEAMERICANCHEMICALSOCIETY

IF:11.444

SCI大类学科：化学1区

日期：2014.2.4

作者：LynnM.McGregor,TaraJain,andDavidR.Liu*

一直以来，有各种面向靶标的配体结合分析方法,包括亲和选择-encoded化学

库,selection-likeinteraction-dependentPCR,和各种各样的筛选平台。其中有些很好的方法

减少了时间和成本，但它们通常依赖于人工环境的纯化的不同的表达蛋白。

这里我要介绍一种一个新的，不同于以往的方法：IDUP。

IDUP（interactiondeterminationusingunpurifiedproteins）是一种从-linked小分子

的混合物和细胞溶解产物非纯化蛋白质的靶标中有选择地扩增可识别配体+靶标对的

序列的方法。

通过在细胞溶解产物中操作，IDUP保护了天然状态下的转录后修饰以及内生合作伙伴

的相互作用，从而确保了difficult-to-purify靶标的研究以及增加检测的潜在生物相关性的相

互作用（与其他需要纯化蛋白质的方法相比）。IDUP还可以应对在细胞溶解产物中衔接蛋

白的亲和力改变的影响，这是使用纯化蛋白的靶标进行配体筛选的方法中所没有的。

（原理：）

IDUP由一个三元复合物的形成而触发（-linked配体、靶蛋白、寡核苷酸），其

中，靶标蛋白质使用-linked抗体与寡核苷酸的附件非共价结合，或使用SNAP-tag

与寡核苷酸的附件共价结合。这个三元复合物的形成取决于Ligand-target绑定。

Ligand-target绑定促进了自我启动U型区域的杂交（聚合酶为了创建一个包含识别靶

标及其配体序列的链使这个区域延长）。这个延伸产物包括两个引物结合位点，所以

可以通过PCR扩增（图1A）。这些编码配位体+靶标对的序列通过PCR有选择地扩增，

通过高通量被显示出来。

实验验证过程：证明了IDUP能够有选择地扩增应用His或者SNAP标记的靶标蛋白与它

们在细胞溶解产物中的配体相互作用的序列，证明IDUP的结果反映了辅助蛋白的调

节ligand-target亲和力的能力。证明了IDUP能够选择性地丰富在SNAP-target-expressing

细胞溶解产物的库和-linked小分子库中对应着已知蛋白质+配体的相互作用亲和力从

0.2nM到26μM的序列。此外，因为观察到序列的总数和ligand-target确认之间的

关系，表明IDUP结果不仅可以识别新的相互作用也可以判断他们的亲和力。

接下来，我将用具体的配体与靶标结合的例子来说明IDUP识别小分子结合库和天然细胞溶

解产物中SNAP-tagged靶标蛋白质之间相互作用的能力。

在说具体应用之前，我先介绍一下介绍来会提到的配体和靶标。

配体与靶标的生物活性：

IdentificationofLigand−TargetPairsfromCombinedLibrariesofSmallMolecuand

UnpurifiedProteinTargetsinCellLysates

Source:JOURNALOFTHEAMERICANCHEMICALSOCIETYIF:11.444

SCIMajorCategory:ChemistryArea1PublicationDate:2014.