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分子生物学与基因工程课程实验思考题试卷及答案

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思考题

1.请简述限制性内切酶识别序列的特点，并解释为什么具有特定识别序列的酶能够精确地在特定位点切割DNA双链。

2.在构建基因表达载体时，选择合适的启动子至关重要。请比较组成型启动子和诱导型启动子的主要区别，并说明在哪些情况下分别选用更合适。

3.PCR技术是分子生物学中最常用的技术之一。请阐述PCR扩增特异性产物的主要保证因素，并说明如果PCR实验结果出现非特异性扩增带，可能的原因有哪些？

4.简述Sanger测序法的核心原理。在进行电泳分离测序产物时，为什么使用琼脂糖凝胶？如果电泳结果中峰图模糊不清，可能涉及哪些操作环节的问题？

5.基因克隆过程中，将重组质粒导入宿主细胞（如大肠杆菌）常用的方法是热激法或钙离子法。请简述热激法的基本原理，并说明热激处理前后需要用冰浴冷却的原因。

6.假设你想要检测某基因在特定组织或细胞类型中的表达水平，请简述WesternBlot实验的基本步骤，并说明其中关键的抗体是哪一种，它在实验中起什么作用？

7.CRISPR/Cas9系统在基因编辑领域具有革命性意义。请简述该系统的基本工作原理，包括Cas9蛋白如何识别目标DNA序列，以及如何实现基因的切割。

8.在进行基因功能研究时，构建基因敲除（Knockout）或基因敲入（Knock-in）小鼠模型是重要手段。请比较这两种技术的基本思路和主要区别，并说明各自的优势和应用场景。

9.考虑一个实验场景：你需要从一个复杂样本（如基因组DNA）中纯化特定基因片段。你会选择PCR技术还是凝胶电泳回收技术？请说明你的选择依据，并简述所选技术的关键步骤。

10.如果你在进行基因克隆实验后，转化了大肠杆菌，但在选择性培养基上没有观察到任何菌落生长，请分析可能的原因，并说明可以采取哪些措施进行排查。

试卷答案

1.限制性内切酶识别序列通常具有以下特点：①长度较短，通常为4-8个碱基对；②具有高度的序列特异性，即酶只能识别和切割特定的碱基序列；③识别序列通常存在回文结构，即其正向和反向互补序列相同。具有特定识别序列的酶之所以能精确切割DNA双链，是因为酶的活性位点与识别序列通过氢键等非共价键形成稳定的结合，这种结合具有高度特异性，只有完全匹配或高度相似的序列才能被有效识别并发生切割反应。

2.组成型启动子和诱导型启动子的主要区别在于：①组成型启动子能在宿主细胞的各种生理条件下持续驱动基因表达，不受外界信号调控；②诱导型启动子则只有在特定诱导剂存在时才被激活，从而驱动基因表达。选择合适的启动子取决于实验目的：如果需要持续稳定地表达目标基因，应选择组成型启动子；如果希望根据实验需求控制基因表达，避免持续浪费能量或产生毒性蛋白，则应选择诱导型启动子。

3.PCR扩增特异性产物的主要保证因素包括：①引物设计的特异性，引物序列应与模板DNA目标区域完全或高度互补，且不在模板内部形成二聚体或发夹结构；②退火温度的优化，合适的退火温度能确保引物与模板稳定结合，同时避免非特异性结合；③PCR缓冲液和镁离子浓度的适宜，这些因素影响引物和Taq酶的活性及DNA解链温度。PCR实验结果出现非特异性扩增带的可能原因有：①引物设计不合理，如引物长度不合适、存在引物二聚体位点或非特异性结合位点；②退火温度过低或梯度范围设置不当；③镁离子浓度过高；④Taq酶活性不够或受到抑制；⑤模板DNA纯度差或含有抑制剂。

4.Sanger测序法的核心原理是基于DNA聚合酶的延伸反应，该反应需要引物、四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）和带有荧光标记的终止子（dideoxynucleotidetriphosphates,dNTPs）。反应在模板链存在下进行，DNA聚合酶从引物起始，沿着模板链延伸，随机地在遇到A、T、C、G四种碱基时，选择相应的dNTP进行添加。当添加了带有终止子（缺乏3-OH基团）的dNTP时，延伸反应终止，产生一系列长度不等的片段。通过将这些片段进行琼脂糖凝胶电泳分离，根据片段大小确定每个延伸产物所添加的碱基，从而读取模板链的序列信息。使用琼脂糖凝胶电泳分离测序产物是因为其操作简便、快速、成本较低，且能较好地分离不同大小的DNA片段。电泳结果中峰图模糊不清可能涉及的操作环节问题包括：①凝胶浓度不合适或制备不规范；②电泳缓冲液pH值或离子强度不适宜；③电泳条件（电压、时间）控制不当；④测序反应本身产物质量差，如dNTPs或引物用量的失衡；⑤荧光标记不均匀或检测仪器分辨率不高。

5.热激法的基本原理是利用高温（通常为42°C）短暂处理含有感受态细胞的冰冷溶液，使细胞膜的流动性瞬间增加，形成暂时的孔隙，从