核酸和蛋白质分析技术.pptVIP

（1）变性温度：94-95℃Templete：GC比例高、长度很长，则变性T↑（2）退火：温度越高，扩增特异性越好取决于Tm值：Tm↑退火T↑；Tm↓退火T↓若Tm较高，可使退火和延伸在同一温度（3）延伸：?500nt1min?500nt－－3min一般：40－60sec6.温度和时间：第29页，共81页，星期日，2025年，2月5日（三）PCR技术的应用1.基因检测：2.基因克隆化3.DNA突变4.DNA序列分析第30页，共81页，星期日，2025年，2月5日四、基因芯片利用核酸杂交的原理，应用于DNA、RNA的研究背景资料

基因芯片（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）就是利用点样机等机械装置，在玻璃等支持物表面整齐地点上高密度的、成千上万个“点”，每个“点”含有可与一种基因杂交的一条ＤＮＡ探针。由于芯片上有序地排列着ＤＮＡ探针，因此也被称为微阵列（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）。在芯片上滴加样品后，在合适的条件下，样品中含有的各种核酸片段（ｃＤＮＡ或ｃＲＮＡ）就与相应的探针杂交。由于核酸片段上已标记有荧光素，激发后产生的荧光强度就与样品中所含有的相应核酸片段的量成正比，也就代表该基因的表达量。经激光共聚焦扫描仪等装置扫描后，所获得的信息经专用软件分析处理，即可获得成千上万种基因的表达情况。正因为这种特点，基因芯片技术已成为当前生命科学研究的热点之一。第31页，共81页，星期日，2025年，2月5日操作流程（1）探针的设计、合成与芯片的制作（商品化产品）；（2）靶基因样品的制备；靶基因的制备：RT-PCR（设实验组和对照组）标记方法：分别进行荧光素标记如：Cy3和Cy5（3）生化杂交反应；与常规的分子杂交过程基本相似封闭预杂交杂交洗脱（4）杂交信号的检测与结果的分析激光共聚焦荧光检测系统收集荧光信号，计算机分析第32页，共81页，星期日，2025年，2月5日基因芯片的应用用于基因转录水平的检测、基因组分析和后基因组研究举例：美国斯坦福大学Davis等用PCR法从外周血淋巴细胞cDNA文库中得到了1046种cDNA片段，制成芯片，然后与热处理的T淋巴细胞和未处理的T细胞种提取的mRNA反转录出的单链cDNA片段杂交，经激光共聚焦扫描系统分析，共发现17个差异表达的基因，其中11个是被热诱导的，6个是被热抑制的。经序列分析证实，其中3个是未报导的新基因。第33页，共81页，星期日，2025年，2月5日第二节蛋白质分析技术讲述内容：一、WesternBlot二、ELISA三、免疫荧光技术四、免疫组织化学技术五、蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术第34页，共81页，星期日，2025年，2月5日一WesternBlot1原理：将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。第35页，共81页，星期日，2025年，2月5日2操作过程SDS电泳转膜（PVDF或硝酸纤维素膜）封闭一抗洗涤酶标二抗反应洗涤显色或化学发光显影第36页，共81页，星期日，2025年，2月5日Hours04816?WesternblotanalysisofthecleavageofCaspase-3.IM9/Bcl-2Cellsweretreatedwith20?Mofgossypolfor4,8and16h.Aftertreatment,cellswereharvestedandlysedinlysisbuffer.50ugofproteinwasloadedineachlaneandtheexpressionofactinwasdetectedasaloadingcontrol?第37页，共81页，星期日，2025年，2月5日0h4h