第七章基因芯片技术.pptVIP

基因芯片使用步骤芯片制作把探针固定于载体表面样品处理目标分子富集分子间的杂交结果检测与数据分析第30页，共81页，星期日，2025年，2月5日基因芯片的制作方式原位合成直接点样原位光蚀刻合成原位喷印合成分子印章法针式点样喷墨点样光导原位合成法第31页，共81页，星期日，2025年，2月5日1、原位光蚀刻合成寡聚核苷酸原位光蚀刻合成技术是由Affymetrix公司开发的，采用的技术原理是在合成碱基单体的5羟基末端连上一个光敏保护基。合成的第一步是利用光照射使羟基端脱保护，然后一个5端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合成完毕。使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指数增长。某一含n个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4×n个化学步骤能合成出4n个可能结构。例如：一个完整的十核苷酸通过32个化学步骤，8个小时可能合成65,536个探针。第32页，共81页，星期日，2025年，2月5日目前美国Affymetrix公司已有同时检测6,500个已知人类基因的DNA芯片，并且正在制备含500,000-1,000,000个寡核苷酸探针的人类基因检测芯片。该公司每月投入基因芯片研究的经费约100万美元。该产品不仅可用于基因表达分析和基因诊断等，而且在大规模药物开发方面也具有诱人的前景。目前，用于分子诊断的DNA芯片不仅已可用于检测爱滋病病毒基因还可用于囊性纤维化（CF）、乳腺癌、卵巢癌等疾病相关基因的基因诊断。鉴于光刻设备技术复杂，只能有专业化公司生产，加之成本高及合成效率不高的问题，因此有待进行以下研究：⑴对光刻技术进行改进，提高合成效率；⑵开发新的原位合成技术，如喷印合成技术，该技术既能进行原位合成又能进行非原位合成。第33页，共81页，星期日，2025年，2月5日2、光导原位合成法是在经过处理的载玻片表面铺上一层连接分子（linker），其羟基上加有光敏保护基团，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（photolithographicmask）保护不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羟基上的保护基团，游离羟基，利用化学反应加上第一个核苷酸，所加核苷酸种类及在芯片上的部位预先设定，所引入的核苷酸带有光敏保护基团，以便下一步合成。然后按上述方法在其它位点加上另外三种核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而N个核苷酸长的芯片需要4N个步骤。每一个独特序列的探针称为一个“feature”，这样的芯片便具有4N个“feature”，包含了全部长度为N的核苷酸序列。这种原位直接合成的方法无须制备处理克隆和PCR产物，但是每轮反应所需设计的光栅则是主要的经费消耗。运用这种方法制作的芯片密度可高达106探针/平方厘米，即探针间隔为5－10μm，但只能制作II型DNA芯片。第34页，共81页，星期日，2025年，2月5日第35页，共81页，星期日，2025年，2月5日3、原位喷印合成芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。喷印头可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。该技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，因此不特殊制备的化学试剂。第36页，共81页，星期日，2025年，2月5日4、点样法点样法是将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。点样分子可以是核酸也可以是寡核酸。采用人工点样的方法将寡核苷酸分子点样于化学处理后的载玻片上，经一定的化学方法处理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于载玻片上，制备好的DNA芯片可置于缓冲液中保存。用多聚赖氨酸包被固相支待物玻片，经过分区后用计算机控制的微阵列点样机按照预先设计顺序点上核酸分子，点样量很小，约为5nl。大规模CDNA芯片多采用这种方法，与其寡核苷酸微芯片相比。DNA芯片的潜在优越性是具有更强的亲和势和特异性杂交，但是需要大量制备，纯化，量化，分类PCR产物。第37页，共81页，星期日，2025年，2月5日玻璃片基的处理：使玻璃表面获得羟基、醛基、氨基等活性基团。点样针沾取探针溶液。点样针把探针点到玻片表面，让探针末端的化学集团与玻片表面的集团形成共价键。针式点样的优缺点优点：成本低，操作简单，密度高（几千-几十万点/cm2)，转移过程中探针溶液损失小。缺点：定量准确性、重现性不好针式点样第38页，共81页，星期日，2025年，2月5日