重组子筛选鉴定方法.pptx

第七章重组子的筛选和鉴定

载体标记筛选法第一节遗传表型直接筛选法

载体上的抗药基因：抗氨苄青霉素基因(Ap或Amp)抗四环素基因(Tc或Tet)抗卡那霉素基因等(Kn或Kan)凡是转入了载体的细胞都获得了这种抗药性，可以在平板上生长菌落。（一）根据载体的抗药性标记进行筛选

（二）插入失活选择法pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因:Tetr和Ampr。Tetr上有插入位点BamHI和SalI;Ampr上有插入位点PstI。1.原理：

2.选择过程如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素平板培养基选择重组克隆。（1）四环素抗性插入失活含有两个以上的抗药基因的载体，外源DNA片段插入其中一个基因，并导致这个基因的失活，就可用两个含不同药物的平板，互相对照，筛选含重组DNA的菌落，这就是插入失活效应。

外源基因抗Amp抗Tet抗Amp抗Amp抗Tet抗Tet重组DNA空载体不含有载体或重组DNA

（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。

(3)双抗菌素抗性选择标记插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞?在Amp或Tet中都死亡。获得重组载体的寄主细胞?在Amp或Tet其中之一中死亡。

（三）、?-半乳糖苷酶显色反应选择法

1.原理——?互补载体上有一段?-半乳糖苷酶基因（LacZ）的?片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。受体菌基因组中有突变的?-半乳糖苷酶基因（?片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的?-半乳糖苷酶。+?-半乳糖苷酶乳糖半乳糖葡萄糖X-gal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝+深蓝色

2.选择过程

?-半乳糖苷酶使X-gal分解成兰色产物。