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细胞划痕实验操作步骤与注意事项

细胞划痕实验，作为一种操作相对简便、成本较低且能直观反映细胞迁移能力的经典体外实验方法，在细胞生物学、肿瘤学及药理学等领域得到了广泛应用。其基本原理是通过在融合的单层细胞上制造一道“伤口”，然后在不同时间点观察细胞向划痕区域迁移、填充“伤口”的过程，以此评估细胞的迁移潜能或特定因素对细胞迁移的影响。本文将结合实践经验，详细阐述该实验的操作步骤与关键注意事项，以期为科研工作者提供有益参考。

一、实验原理简述

当融合的单层细胞受到机械损伤（即划痕）后，处于划痕边缘的细胞会感受到这种损伤信号，并被激活。随后，这些细胞会经历一系列生物学过程，包括细胞形态改变、细胞骨架重排、细胞外基质降解以及细胞增殖与迁移等，最终使划痕区域逐渐缩小直至愈合。通过在不同时间点对划痕宽度进行测量和比较，即可定量分析细胞的迁移能力。

二、主要实验材料与试剂

1.细胞系：根据实验目的选择合适的贴壁细胞系。

2.细胞培养基：含血清培养基（用于常规培养）、无血清培养基或低血清培养基（用于划痕后抑制细胞增殖，更专注于迁移；具体血清浓度需预实验摸索）。

3.PBS缓冲液：用于清洗细胞。

4.培养板：通常选用6孔板、12孔板或24孔板，选择依据主要考虑细胞大小、观察时间窗及成像需求。6孔板因操作空间大、划痕清晰，较为常用。

5.无菌移液枪及配套枪头、培养皿、离心管等常规细胞培养耗材。

6.marker笔（用于在培养板底部标记划痕位置，便于后续观察）。

7.直尺（辅助划线，确保划痕平直）。

8.倒置显微镜及成像系统：用于观察和记录划痕图像。

9.胰蛋白酶-EDTA消化液：用于细胞传代。

10.相关处理因素：如药物、siRNA、质粒等（根据实验设计而定）。

三、详细操作步骤

3.1细胞准备与接种

首先，取处于对数生长期的目标细胞，用胰蛋白酶-EDTA消化液常规消化、离心后，用含血清的完全培养基重悬细胞，吹打均匀，制成单细胞悬液。进行细胞计数后，根据所选培养板的规格和实验要求，将适量的细胞悬液接种到培养板的每个孔中。接种密度是关键，一般建议接种后在合适的培养条件下（通常为37℃、5%CO?恒温培养箱）培养至次日细胞融合度达到90%-100%。过高或过低的融合度都会影响后续划痕的质量和实验结果的一致性。

3.2细胞单层培养与划痕前准备

待细胞完全融合成致密单层后，实验正式开始。首先，用marker笔在培养板的底面，避开细胞生长区域，轻轻标记出划痕的位置和方向。为保证实验的可重复性和数据的可比性，通常在每个孔的底部标记至少两条相互平行的直线，最好是横贯整个孔。标记时动作要轻，避免用力过大损坏培养板底部或影响细胞。标记完成后，将培养板置于显微镜下，确认标记线清晰可见且不影响细胞。

3.3划痕的制作

这一步是实验的核心操作之一，手法的稳定性直接影响划痕的均一性。推荐使用无菌的200μL或100μL移液枪枪头（注意枪头需是未使用过的无菌枪头，或在酒精中浸泡后过火灭菌并冷却，但过火灭菌可能会影响枪头的光滑度，需谨慎）。手持枪头，垂直于培养板底面，沿着预先标记好的直线，轻轻且匀速地划过细胞单层。划过时力度要适中，既要确保划断所有细胞，形成清晰的划痕，又要避免用力过猛刮伤培养板底面的塑料层，以免影响后续的显微镜观察和图像分析。每划完一个孔，建议更换新的枪头，以防止不同样本间的交叉污染。

3.4划痕后清洗与培养

划痕完成后，培养板孔内会出现大量脱落的细胞和细胞碎片，这些碎片若不清除，会干扰后续的观察和细胞迁移。因此，需用预热的PBS缓冲液轻轻冲洗划痕区域2-3次。冲洗时，移液枪的枪头应贴近培养板孔壁缓慢加液，避免直接冲击划痕处的细胞，导致边缘细胞脱落。清洗完毕后，吸弃PBS，根据实验设计加入无血清培养基或特定血清浓度的培养基（若要研究细胞迁移，通常使用无血清或低血清培养基以排除细胞增殖的影响；若需同时观察增殖和迁移，可使用含血清培养基）。若实验涉及药物处理，则在此步骤加入含相应浓度药物的培养基。

3.5划痕愈合过程的动态观察与图像采集

将处理好的培养板放回37℃、5%CO?恒温培养箱中继续培养。随后，在0小时（即刻）、6小时、12小时、24小时、48小时等预设的时间点（具体时间点需根据细胞迁移速度和实验目的灵活设定）取出培养板，在倒置显微镜下观察划痕区域。选择标记线交叉处或划痕的特定固定位置进行拍照记录，确保每次拍照的是同一视野，这样才能准确比较不同时间点的划痕宽度变化。拍照时，建议使用相同的放大倍数（如100倍或200倍）和曝光参数，以保证图像的可比性。

四、关键注意事项

4.1细胞状态与融合度

细胞状态是实验成功的首要前提。务必选择生长状态良好、形态均一、无污染的对数生长期细胞进行实验。老化或状态不佳的细