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螺旋体(Spirochaete)
短螺旋体属(Brachyspira)
短螺旋体属最早归类于密螺旋体属。1991年,Stanton等将此属归入新建的蛇螺旋体属。1997年0chiai等又将蛇螺旋体属归入新建的短螺旋体属。短螺旋体属成员的细胞呈疏松、规则的螺旋形,长7~9μm,宽0.3~0.4μm,能屈曲或蛇形运动。该属主要成员包括阿勒堡短螺旋体(B.aalborigi)、鸡痢疾短螺旋体(B.alvinipμlli)、猪痢疾短螺旋体(B.hyodysenteriae)、无害短螺旋体(B.innocens)、中间短螺旋体(B.intermedia)、默多齐短螺旋体(B.murdochii)、大肠毛状短螺旋体(B.pilosicoli)等。
猪痢疾短螺旋体(B.hyodysenteriae)
猪痢疾短螺旋体引起猪的肠道感染,以大肠黏膜卡他性、出血性和坏死性炎症为特征,导致发病猪黏液性出血性下痢。猪痢疾于1921年在美国首次发现,但直到1972年才发现该病的病原为螺旋体,并命名为猪痢疾密螺旋体,1991年将其命名为猪痢疾蛇形螺旋体,现在统一命名为猪痢疾短螺旋体。
1.形态染色
猪痢疾短螺旋体菌体长6~9μm,直径0.3~0.5μm,多为2~4个弯曲,两端尖锐,形似双燕翅状[图11-4-1(a)]。在暗视野显微镜下,可见其进行活泼的蛇形运动。菌体表面有鞭毛,这有助于其穿透并向肠壁上皮黏膜进行移动。
猪痢疾短螺旋体革兰染色呈阴性,维多利亚蓝、姬姆萨和银染法均能使其较好着色。在扫描电子显微镜下观察,菌体呈蛇形、弯曲状[图11-4-1(b)]。
2.培养特性
猪痢疾短螺旋体对生长条件和营养要求苛刻,需要严格厌氧条件,一般在一个大气压、80%~95%N?和5%~20%CO?条件下,37~42℃培养5~7天。培养时通常需要加入10%的胎牛血清或者新鲜血液的胰酪大豆胨液体培养基(TSB)和脑心浸液(BHIB)的液体或固体培养基中才能生长。在血平板上可见强β溶血环,呈云雾状生长而无可见菌落。在基础培养基中选择性地加入抗菌药如多黏菌素B、壮观霉素、万古霉素和利福平等,可提高本菌从肠道样品中的分离率。
3.生化反应
本菌能分解葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖等,产酸不产气,吲哚试验阳性、β-葡萄糖苷酶活性阳性,不水解马尿酸,不液化明胶,不产生硫化氢,细胞色素氧化酶、触酶阴性。
4.分离鉴定
(1)猪痢疾短螺旋体分离鉴定流程:取带有血丝的黏液少许或大肠黏膜直接涂片,姬姆萨染色镜检;或将病料涂在载玻片,加水一滴,在相差显微镜或暗视野显微镜下检查。如观察到呈蛇形运动的螺旋体,即可初步确诊。取新鲜病料,划线接种于添加药物的TSB肉汤或血琼脂平板上,在严格厌氧条件下培养5~7天。见有明显溶血时,即可取出镜检。对可疑菌落在血琼脂平板上纯化培养,并选择商品化试剂进行生化鉴定和PCR检测。
(2)生化鉴别:挑取溶血菌株进行生化试验,针对螺旋体的溶血性以及能否产生吲哚和水解马尿酸,对螺旋体种类进行鉴别。
(3)动物试验:将溶血菌株注射健康家兔,5~10天后做睾丸穿刺检查看有无猪痢疾短
螺旋体存在;也可用10~12周龄的猪做结肠结扎试验,根据结扎肠段有无特征性变化而予以诊断。
(4)PCR鉴定:对分离纯化的培养物用煮沸法提取细菌DNA,特异性引物和反应条件如下。
P1:5-ACTAAAGATCCTGATGTATTTG-3
P2:5-CTAATAAACGTCTGCTGC-3
扩增产物大小:354bp。
PCR反应程序:94℃预变性5min;94℃变性30s,52℃退火30s,72℃延伸30s,30个循环;72℃延伸10min。
钩端螺旋体属(Leptospira)
钩端螺旋体属又称为细螺旋体属,其特征是菌体纤细、螺旋致密,一端或两端弯曲呈钩状的螺旋体,简称钩体。该属成员大部分营腐生生活,广泛分布于自然界,尤其存活于各种水生环境中,无致病性;小部分为寄生性和致病性,可引起人和动物的钩端螺旋体病(简称钩体病),是一种人兽共患病。钩端螺旋体病的临床症状复杂,早期极易误诊。实验室菌体培养历时较长,需要7~10天。随着分子生物学技术的发展,PCR检测技术已广泛应用于本病的检测中。
1.形态染色
钩端螺旋体是一类菌体细长、弯曲、规则而紧密的单细胞微生物,直径约为0.1μm,长度为6~20μm。钩端螺旋体只能在暗视野或相差显微镜下观察到。钩端螺旋体螺旋一端或两端弯曲呈钩状,常使菌体呈C形或S形等形状。钩端螺旋体运动活泼,在液体环境下,沿着长轴旋转,两端柔软,呈扭动运动。外膜位于原生质和轴丝的外层,相当于细菌荚膜,由多糖、脂类和蛋白质组成,具有良好的抗原性。
钩端螺旋体革兰染色阴性,但较难着色。镀银染色法和刚果红负染效果较好。
2.培养特性
钩端螺旋体较易培养,在含有5%~10%兔血清的
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