一种体内检测ROP蛋白活性的方法及应用.PDFVIP

果树学报2023，40（10）：2252-2262

JournalofFruitScience

DOI:10.13925/ki.gsxb

一种体内检测ROP蛋白活性的方法及应用

张皓，刘雪莹，贺千可，王鹏，张绍铃，吴巨友*

（南京农业大学园艺学院·江苏省梨工程研究中心，南京210095）

摘要：【目的】建立一种体内检测ROP蛋白活性的方法，为进一步研究ROP蛋白的功能提供技术支持。【方法】该方法

基于RIC作为ROP蛋白的效应子能特异地与活性形式的ROP结合这一特点，通过荧火素酶互补试验，借助烟草瞬时

表达系统，利用植物活体成像仪和酶标仪进行定性或定量检测荧光强度，从而实现体内检测ROP蛋白的活性。【结果】

以拟南芥AtRIC1为检测基因，以AtROP1为例来检测其蛋白活性，成功检测到了AtROP1与AtRIC1有荧光，表明它们

有互作。同时对AtROP1蛋白进行了点突变试验，成功构建了持续激活态的ROP1（AtROP1-CA）和持续失活态的

ROP1（AtROP1-DN）载体，通过定性定量检测，发现与AtROP1-DN相比，AtRIC1与AtROP1-CA有更强的荧光信号，表

明AtRIC1可以作为检测蛋白来检测AtROP1蛋白的活性。此外，通过引入3个蛋白（以AtGAP1、AtGDI1和AtGEF1蛋

白为例），利用该方法进一步检测，表明AtGAP1和AtGDI1作为AtROP1蛋白活性的抑制因子，明显降低了AtROP1蛋

白的活性；而AtGEF1作为AtROP1蛋白活性的促进因子，明显提高了AtROP1蛋白的活性，说明该方法还可以通过At-

RIC1检测其他蛋白对AtROP1蛋白活性的影响。同时，该方法还解决了之前单一的pull-down试验检测ROP蛋白活性

变化的问题，增加了一种新的体内检测ROP蛋白活性的方法。【结论】与其他方法相比，该方法具有高灵敏度、可视化、

可定量化和操作简单等特点，并且适用于检测其他蛋白对ROP蛋白活性的影响，所以该方法是一种可靠的体内检测

ROP蛋白活性的新方法。

关键词：ROP蛋白；RIC蛋白；荧火素酶

中图分类号：Q94文献标志码：A文章编号：1009-9980(2023)10-2252-11

AmethodforROPproteinactivitydetectioninvivoanditsapplication

ZHANGHao,LIUXueying,HEQianke,WANGPeng,ZHANGShaoling,WUJuyou*

(CollegeofHorticulture,NanjingAgriculturalUniversity/PearEngineeringResearchCenterofJiangsuProvince,Nanjing210095,Jiang-

su,China)

Abstract:【Objective】ThisworkaimedtoestablishamethodfordetectingROPproteinactivityin

plantsandtoprovidesometechnologicalsupportforfurtherstudiesonthefunctionofROPproteins.

【Methods】TheworkingprincipleofthemethodwasmainlybasedonthefactthatRIC,asaneffector

oftheROPprotein,specificallybindstotheactiveformofROPproteins.Throughtheluciferasecom-

plementationassay,withthehelpoftheAgrobacterium-mediatedtobacco