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岩藻多糖酶产生菌的筛选及其酶学特性研究

一、引言

岩藻多糖作为一种具有多种生物活性的海洋多糖，在医药、食品、化妆品等领域具有广阔的应用前景。而岩藻多糖酶能够特异性降解岩藻多糖，其高效生产对于岩藻多糖的开发利用至关重要。因此，筛选出高产岩藻多糖酶的菌株，并深入研究其酶学特性，具有重要的理论和实践意义。

二、岩藻多糖酶产生菌的筛选

（一）材料与方法

样品采集：分别从海洋沉积物、海藻表面以及海水等不同海洋环境中采集样品。采集过程中，使用无菌采样瓶，确保样品不受污染。

培养基：

富集培养基：以岩藻多糖为唯一碳源，添加适量的氮源（如蛋白胨、酵母提取物等）、无机盐（如氯化钠、磷酸二氢钾等），调节pH至适宜范围（7.0-7.5），121℃高压灭菌20分钟备用。

筛选培养基：在富集培养基的基础上添加琼脂，制成固体培养基，用于菌株的分离纯化。

富集培养：将采集的样品分别接种到富集培养基中，在适宜的温度（25-30℃）下，摇床培养（150-200r/min）3-5天，进行富集培养，增加目标菌株的数量。

分离纯化：取富集培养后的菌液，进行梯度稀释（10-1、10-2、10-3……10-6），然后分别取不同稀释度的菌液涂布于筛选培养基平板上，置于适宜温度下培养2-3天。待平板上长出单菌落后，挑选形态各异的菌落，采用划线分离法进行多次纯化，直至获得纯培养菌株。

（二）初筛

将纯化后的菌株分别接种到以岩藻多糖为唯一碳源的液体培养基中，在相同条件下培养一定时间后，测定培养液中岩藻多糖酶的活力。根据酶活力的大小，初步筛选出具有产酶能力的菌株。

（三）复筛

对初筛得到的菌株进行复筛。将菌株接种到新鲜的液体培养基中，在优化的培养条件下培养，再次测定酶活力。经过多次重复实验，筛选出酶活力较高且稳定的菌株，作为目标菌株。

三、岩藻多糖酶的酶学特性研究

（一）酶的提取与纯化

将筛选得到的目标菌株进行大量培养，收集发酵液。采用离心法去除菌体沉淀，得到粗酶液。然后通过硫酸铵盐析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对粗酶液进行纯化，获得较纯的岩藻多糖酶。

（二）最适温度测定

在不同温度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）下，以岩藻多糖为底物，在相同的pH和反应时间条件下，测定岩藻多糖酶的活力。以最高酶活力为100%，计算不同温度下的相对酶活力，绘制酶活力-温度曲线，确定酶的最适温度。

（三）温度稳定性测定

将酶液在不同温度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）下保温不同时间（0min、15min、30min、60min、120min），然后在最适温度下测定剩余酶活力。以未保温的酶活力为100%，计算不同温度和时间下的相对剩余酶活力，评估酶的温度稳定性。

（四）最适pH测定

在不同pH缓冲液（pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）中，在最适温度和相同反应时间条件下，测定岩藻多糖酶的活力。以最高酶活力为100%，计算不同pH下的相对酶活力，绘制酶活力-pH曲线，确定酶的最适pH。

（五）pH稳定性测定

将酶液分别在不同pH缓冲液中，于室温下放置一定时间（如1h），然后在最适pH和最适温度下测定剩余酶活力。以未处理的酶活力为100%，计算不同pH条件下的相对剩余酶活力，评估酶的pH稳定性。

（六）底物特异性测定

分别以岩藻多糖、其他多糖（如纤维素、淀粉、褐藻酸等）为底物，在最适温度和最适pH条件下，测定岩藻多糖酶对不同底物的催化活力，以评估其底物特异性。

（七）金属离子对酶活力的影响

在反应体系中分别加入不同浓度的金属离子（如Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+等），在最适温度和最适pH条件下测定酶活力。以未加金属离子的反应体系的酶活力为100%，计算不同金属离子存在时的相对酶活力，分析金属离子对酶活力的激活或抑制作用。

四、结果与分析

（一）筛选结果

经过初筛和复筛，从采集的样品中筛选出一株酶活力较高且稳定的岩藻多糖酶产生菌，命名为菌株F-1。该菌株在培养过程中生长状况良好，产酶能力较强。

（二）酶学特性结果

最适温度：菌株F-1产生的岩藻多糖酶的最适温度为50℃，在该温度下酶活力最高。在40-60℃范围内，酶活力保持在较高水平，当温度超过60℃后，酶活力迅速下降。

温度稳定性：该酶在30-50℃范围内具有较好的稳定性，保温120min后，剩余酶活力仍在80%以上；当温度升高到60℃时，保温60min后，剩余酶活力降至50%左右；在70℃下保温30min，酶活力几乎完全丧失。

最适pH：该酶的最适pH为7.0，在pH6.0-8.0范围内，酶活力相对较高；当pH低于5.0或高于