tRNA介导的CRISPR_Cpf1基因编辑效率优化及在兔猪基因修饰中的创新应用.docxVIP

tRNA介导的CRISPR/Cpf1基因编辑效率优化及在兔猪基因修饰中的创新应用

一、引言

1.1研究背景与意义

随着生命科学的飞速发展，基因编辑技术已成为现代生物学领域的核心研究内容之一。其中，CRISPR/Cas系统凭借其操作简便、效率高、成本低等优势，迅速成为基因编辑领域的明星技术，被广泛应用于基因功能研究、疾病治疗、农业育种等多个领域。在众多CRISPR/Cas系统中，CRISPR-Cpf1（Cas12a）作为一种新型的基因编辑工具，因其独特的优势受到了广泛关注。与传统的CRISPR-Cas9系统相比，CRISPR-Cpf1具有只需一个协助RNA分子、酶分子量小易进入细胞、识别序列不同使基因编辑效果更好、剪切位置选择余地大以及产生黏性末端便于新DNA序列插入等优势。然而，CRISPR-Cpf1基因编辑技术在实际应用中仍面临一些挑战，其中编辑效率较低是限制其广泛应用的关键因素之一。

转运RNA（tRNA）作为一类在蛋白质合成过程中起着关键作用的小分子RNA，近年来被发现与基因编辑效率之间存在着密切的联系。tRNA能够通过自身的反密码子识别mRNA上的密码子，并将对应的氨基酸转运至核糖体合成中的多肽链上，从而实现mRNA向蛋白质的翻译过程。研究表明，tRNA可以通过多种机制影响CRISPR-Cpf1基因编辑效率，例如参与crRNA的加工过程，影响Cpf1蛋白与crRNA的结合稳定性，进而影响基因编辑复合物对靶DNA序列的识别和切割效率。因此，深入研究tRNA对CRISPR-Cpf1基因编辑效率的提升作用及其机制，对于优化CRISPR-Cpf1基因编辑技术具有重要的理论意义。

在基因修饰动物模型的构建中，基因编辑效率的高低直接影响到模型构建的成功率和质量。兔和猪作为重要的模式动物和经济动物，在生物医学研究、农业生产等领域具有不可替代的作用。通过基因编辑技术构建基因修饰兔和猪模型，可以为人类疾病的发病机制研究、药物研发以及农业新品种的培育提供有力的工具。然而，目前利用CRISPR-Cpf1技术构建基因修饰兔和猪模型时，编辑效率较低的问题导致模型构建周期长、成本高，限制了相关研究的进展。因此，探索tRNA提高CRISPR-Cpf1基因编辑效率在基因修饰兔和猪中的应用，对于加速基因修饰动物模型的构建，推动生物医学研究和农业生产的发展具有重要的现实意义。

1.2国内外研究现状

在tRNA提高CRISPR-Cpf1基因编辑效率方面，国外研究起步较早。2016年，德国马克斯普朗克感染生物学研究所的研究人员发现CRISPR-Cpf1系统能够独自对crRNA前体进行加工，且不需要来自宿主细胞的核糖核酸酶和tracrRNA，这一发现为tRNA参与CRISPR-Cpf1系统的作用机制研究提供了重要线索。此后，有研究通过优化tRNA的表达水平和序列，发现能够显著提高CRISPR-Cpf1在细胞系中的基因编辑效率。例如，美国某研究团队通过设计特定的tRNA序列，使其与Cpf1蛋白和crRNA形成更稳定的复合物，从而增强了对靶DNA的切割效率，将基因编辑效率提高了30%-50%。

国内相关研究也在近年来取得了一定进展。一些科研团队利用生物信息学方法预测tRNA与CRISPR-Cpf1系统的相互作用位点，并通过实验验证了这些位点对基因编辑效率的影响。如中国科学院的研究人员通过对tRNA的结构进行改造，使其更易于与Cpf1蛋白结合，从而提高了CRISPR-Cpf1在小鼠胚胎干细胞中的基因编辑效率。

在基因修饰兔和猪的研究方面，国外已成功构建了多种基因修饰兔和猪模型，并将其应用于生物医学和农业领域的研究。例如，美国某研究机构利用CRISPR-Cas9技术构建了免疫缺陷猪模型，用于研究人类免疫系统疾病的发病机制和治疗方法。同时，国外也在不断探索提高基因编辑效率的方法，以优化基因修饰动物模型的构建。

国内在基因修饰兔和猪的研究上也取得了显著成果。中国农业科学院的科研团队利用CRISPR-Cas9技术成功培育出了抗猪瘟病毒的基因编辑猪，为猪瘟的防控提供了新的思路和方法。然而，目前国内外关于tRNA提高CRISPR-Cpf1基因编辑效率在基因修饰兔和猪中的应用研究还相对较少，相关的作用机制和应用效果仍有待进一步深入探索。

1.3研究内容与方法

本研究旨在深入探究tRNA对CRISPR-Cpf1基因编辑效率的提升作用及其在基因修饰兔和猪中的应用。具体研究内容包括：一是研究tRNA对CRISPR-Cpf1基因编辑效率的影响机制，通过分子生物学实验和生物信息