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人胰岛素基因改造及山羊乳腺特异性表达载体构建的关键技术与应用探索

一、引言

1.1研究背景与意义

糖尿病是一种由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起的以高血糖为特征的代谢性疾病。近年来，随着全球经济的发展和人们生活方式的改变，糖尿病的发病率呈逐年上升趋势。国际糖尿病联盟（IDF）发布的数据显示，2021年全球糖尿病患者人数已达5.37亿，预计到2030年将增至6.43亿，2045年更是可能达到7.83亿。糖尿病不仅严重影响患者的生活质量，还会引发各种并发症，如心血管疾病、神经病变、视网膜病变和肾病等，给患者的健康带来极大威胁，同时也给社会和家庭带来沉重的经济负担。

胰岛素作为治疗糖尿病的关键药物，对于控制血糖水平、预防和延缓糖尿病并发症的发生发展起着至关重要的作用。胰岛素疗法是治疗1型糖尿病患者的主要手段，用于补充其胰岛素分泌不足，对抗体内拮抗胰岛素的激素，调整代谢紊乱并影响多种脏器的功能和生长发育。对于2型糖尿病患者，虽然胰岛素受体不敏感导致胰岛素相对不足，但使用胰岛素可以调整高血糖、高血脂，控制症状，防止或延缓慢性糖尿病并发症在微血管病变基础上的发生发展。此外，对于妊娠期糖尿病患者，胰岛素治疗能够较好地调整代谢，有利于胎儿发育和顺利分娩。

传统的胰岛素生产方法主要是从动物胰腺中提取，但这种方法存在产量低、成本高、免疫原性强等问题。随着基因工程技术的发展，利用重组DNA技术生产人胰岛素成为主流方法。然而，现有的重组人胰岛素生产系统仍存在一些不足，如大肠杆菌表达系统生产的胰岛素需要经过复杂的体外折叠和修饰过程，哺乳动物细胞表达系统则存在生产成本高、培养条件苛刻等问题。

利用动物乳腺生物反应器生产重组蛋白具有诸多优势，如表达产物具有天然的生物活性、翻译后修饰准确、生产成本低、产量高且易于大规模生产等。山羊作为乳腺生物反应器的理想动物之一，具有繁殖周期短、产奶量高、易于饲养管理等特点。通过构建山羊乳腺特异性表达载体，将人胰岛素基因导入山羊基因组中，使其在乳腺组织中特异性表达人胰岛素，有望获得一种高效、低成本的人胰岛素生产方法，为糖尿病患者提供更加安全、有效的治疗药物，具有重要的理论意义和实际应用价值。

1.2国内外研究现状

在人胰岛素基因改造方面，国内外学者进行了大量研究。早期的研究主要集中在对人胰岛素基因序列的优化，以提高其在宿主细胞中的表达水平和稳定性。例如，通过定点突变技术改变人胰岛素基因的某些碱基，使其密码子偏好性更符合宿主细胞的需求，从而提高翻译效率。有研究采用寡核苷酸介导的定点突变方法，改造人胰岛素基因组基因，将哺乳钠蛋白南前体加工酶Furin的识别和切割位点Arg-X-Lys-Arg-样序列，引入人胰岛素原C肽两端，在普通CHO细胞表达了该改造后的基因，成功提高了人胰岛素的表达量和活性。近年来，随着基因编辑技术的飞速发展，如CRISPR/Cas9、TALENs等技术的出现，为人胰岛素基因改造提供了更精准、高效的手段。中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学课题组利用TALENs及CRISPR技术与单链寡核苷酸结合，建立了猪基因组无痕定点编辑技术，在体细胞中将猪胰岛素基因编码B链第30位丙氨酸的密码子GCC修改为编码苏氨酸的ACG，并获得了纯合子细胞株，成功构建了人源化胰岛素克隆猪。

在山羊乳腺特异性表达载体构建方面，研究也取得了显著进展。乳腺特异性表达载体的构建关键在于选择合适的调控元件，如启动子、增强子等，以确保目的基因能够在乳腺组织中高效、特异性表达。β-酪蛋白基因启动子是常用的乳腺特异性启动子之一，其具有较强的启动活性和组织特异性。有研究将山羊β-酪蛋白基因5’调控区克隆并与目的基因连接，构建了乳腺特异性表达载体，并通过转染山羊乳腺上皮细胞和动物实验验证了其表达效果。此外，一些研究还尝试将不同的增强子元件与启动子结合，以进一步提高目的基因的表达水平。例如，通过生物信息学分析和实验验证，发现奶山羊酪蛋白基因座上存在一些转录因子富集区域，这些区域可能与泌乳期调控内源性酪蛋白基因表达的特异性超级增强子位点有关联，将这些增强子元件与乳腺特异性启动子整合构建嵌合启动子，能够显著提高外源基因在乳腺组织中的表达。

然而，目前的研究仍存在一些不足之处。一方面，人胰岛素基因在山羊乳腺中的表达水平和稳定性还有待进一步提高，以满足大规模生产的需求。另一方面，表达载体的构建还不够完善，存在载体构建复杂、转染效率低、生物安全性等问题。本研究旨在针对这些问题，通过对人胰岛素基因进行进一步改造，优化山羊乳腺特异性表达载体的构建策略，提高人胰岛素基因在山羊乳腺中的表达水平和稳定性，为利用动物乳腺生物反应器生产人胰岛素提供技术支