NF-κB圈套寡核苷酸转染对小鼠成熟树突状细胞生物学特性的影响.docxVIP

NF-κB圈套寡核苷酸转染对小鼠成熟树突状细胞生物学特性的影响

一、实验材料与方法

（一）实验动物

选取6-8周龄SPF级C57BL/6小鼠，雌雄各半，由[实验动物中心名称]提供，动物许可证号：[具体许可证号]。饲养环境温度控制在22-25℃，湿度45%-55%，12h光暗交替，自由摄食饮水。

（二）主要试剂与仪器

试剂：NF-κB圈套寡核苷酸（序列：5-[具体正义链序列]-3，5-[具体反义链序列]-3）、阴性对照寡核苷酸（序列：5-[具体正义链序列]-3，5-[具体反义链序列]-3）购自[试剂公司名称]；小鼠骨髓树突状细胞（DC）分离培养试剂盒购自[试剂盒公司名称]；Lipofectamine?3000转染试剂购自ThermoFisherScientific公司；抗小鼠CD11c-PE、CD80-FITC、CD86-PE-Cy5、MHCⅡ-APC抗体购自BDBiosciences公司；TNF-α、IL-12p70、IL-10ELISA检测试剂盒购自RDSystems公司。

仪器：流式细胞仪（型号：[具体型号]，BD公司）、酶标仪（型号：[具体型号]，Bio-Tek公司）、倒置荧光显微镜（型号：[具体型号]，Olympus公司）、CO?培养箱（型号：[具体型号]，ThermoFisherScientific公司）。

（三）小鼠成熟DC的分离培养与鉴定

颈椎脱臼法处死小鼠，无菌分离双侧股骨和胫骨，用生理盐水冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬液。

红细胞裂解液裂解红细胞，离心（1500r/min，5min）收集沉淀，用含10%胎牛血清、10ng/mLGM-CSF、5ng/mLIL-4的RPMI-1640培养基重悬细胞，调整细胞浓度为2×10?/mL，接种于6孔板，置于37℃、5%CO?培养箱中培养。

培养第3天半量换液，第6天收集悬浮细胞和轻度贴壁细胞，即为未成熟DC。向未成熟DC中加入100ng/mLLPS，继续培养24h，诱导分化为成熟DC。

流式细胞术鉴定成熟DC：收集细胞，用PBS洗涤2次，加入抗小鼠CD11c-PE、CD80-FITC、CD86-PE-Cy5、MHCⅡ-APC抗体，4℃避光孵育30min，PBS洗涤后，流式细胞仪检测CD11c?细胞表面CD80、CD86、MHCⅡ分子的表达水平，CD11c?CD80?CD86?MHCⅡ?细胞比例≥80%即为成熟DC。

（四）NF-κB圈套寡核苷酸转染成熟DC

将鉴定合格的成熟DC分为3组：空白对照组（不进行任何处理）、阴性对照组（转染阴性对照寡核苷酸）、NF-κB圈套组（转染NF-κB圈套寡核苷酸）。

转染前1天，将成熟DC接种于6孔板，调整细胞浓度为1×10?/mL，培养至细胞融合度达70%-80%。

按照Lipofectamine?3000转染试剂说明书进行操作，分别将阴性对照寡核苷酸和NF-κB圈套寡核苷酸与转染试剂混合，室温孵育15min后，加入到对应孔中，继续培养24h。

转染效率检测：取部分转染后的细胞，用倒置荧光显微镜观察荧光表达情况，流式细胞术检测荧光阳性细胞比例，以评估转染效率。

（五）生物学特性检测

细胞形态观察：转染24h后，倒置显微镜下观察各组DC的形态变化，拍照记录。

表面分子表达检测：收集各组细胞，按照上述流式细胞术鉴定成熟DC的方法，检测CD11c?细胞表面CD80、CD86、MHCⅡ分子的表达水平。

细胞因子分泌检测：收集各组细胞培养上清液，按照TNF-α、IL-12p70、IL-10ELISA检测试剂盒说明书进行操作，检测上清液中细胞因子的含量。

刺激T细胞增殖能力检测：采用MTT法检测DC刺激T细胞增殖的能力。无菌分离小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，用尼龙毛柱法纯化T细胞，调整T细胞浓度为5×10?/mL。将各组DC用丝裂霉素C（终浓度为50μg/mL）处理30min，以灭活DC的增殖能力，然后将DC与T细胞按照1:10、1:20、1:40的比例接种于96孔板，每组设3个复孔，培养48h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），继续培养4h，弃去上清液，每孔加入150μLDMSO，振荡10min，酶标仪在490nm波长处检测吸光度（OD值），计算T细胞增殖率：T细胞增殖率=（实验组OD值-空白组OD值）/（空白组OD值）×100%。

凋亡检测：采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。收集各组细