植物基因工程载体及其构建.pptVIP

DSBR:首先是植物靶DNA产生双链断裂，解旋的靶DNA与T-DNA退火；单链部分被核酸内切酶去除；然后进行修复连接，并导致缺失SSGR①在靶DNA上形成一个缺刻，然后由于部分解旋或酶消化形成缺口；②单链T-DNA靠近缺口，由于两链存在短的互补顺序，于是退火形成异质双链；③T链未配对的5’和3’单键部分被除去，T-DNA末端与靶DNA连接；④在靶DNA链的互补链产生缺刻，以游离的3’DNA末端为引物修复合成第二条T-DNA链。修复与复制是T-DNA整合中的重要机理之一。因此T-DNA优先整合进植物染色体转录活跃区，反映了该区的各种拓扑结构如D环、缺刻、缺口、断裂等适合于T-DNA的整合。综上所述，T-DNA的整合是通过植物靶DNA和TDNA间短的同源区段发生重组而完成的，在接口附近伴有DNA顺序的转换和重复。Mxsore等人（2000）的研究证明，组蛋白H2A和T-DNA与植物基因组的整合有关。已知T-DNA可插入多个物理位点，T-DNA可几个拷贝连锁在一起，也可以分别插入不同位点。当多拷贝T-DNA进入同一植物细胞后，这些拷贝之间可能相互作用，导致基因的沉默，这种现象现被称为共抑制（co-suppression）。（1）T-DNA的插入不引起植物DNA大的重排，但多数插入会导致靶位点处小的缺失，缺失多至79个核苷酸。（2）在T-DNA／植物DNA连接处，会有几个至33个核苷酸的“填充”DNA（filerDNA）存在，这些“填充”DNA的序列与靠近连接处的植物DNA序列相似。（3）在植物靶位处不要求有特异的序列，但若在T-DNA两端和植物靶位处之间有一段短序列（5～10bp）同源，则利于整合。（3）T-DNA整合的遗传效应Chv同样参与细菌的附着。ChvA,B,C基因发生突变使根癌农杆菌与植物细胞的滩附率降低10倍。这三个基因与环状a-1，2-葡聚糖的合成和运输有关。ChvB基因产物催化合成葡聚糖；ChvA编码产物则与多糖从胞质转运到胞外有关，pscA位点与环化葡聚糖和琼山酸多聚糖的合成有关。除上述基因外，还有一些染色体基因在T-DNA转移过程中起重要作用。目前巳知农杆菌染色体上有10个基因与T-DNA转移有关。7.3.3、农杆菌染色体基因对T-DNA转移的调控第四节、农杆菌Ti质粒的改造及载体构建（1）目的基因克隆载体：（2）中间克隆载体：中间克隆载体是由大肠杆菌质粒插入T－DNA片段及目的基因、标记基因等构建而成。它是构建中间表达载体的基础质粒。（3）中间表达载体：中间表达载体是含有植物特异启动子的中间载体，其功能是作为构建转化载体的质粒。（4）卸甲载体：卸甲载体是解除武装的Ti质粒或Ri质粒，其功能是作为构建转化载体的受体质粒。（5）植物基因转化载体：植物基因转化载体是最后用于目的基因导入植物细胞的载体，故亦称工程载体。它是由中间表达载体和卸甲载体构建而成。根据它的结构特点又可分为两种转化载体，即一元载体系统和双元载体系统。把载体构建过程称为植物基因工程的上游技术，把转化称为下游工作。野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体存在如下障碍：①Ti质粒分子量过大，比pBR322质粒大50倍左右；②分布着各种限制酶的多个切点；③T-DNA区内含有许多编码基因，其中onc基因的产物干扰宿主植物中内源激素的平衡，使转化细胞长肿瘤，阻碍细胞的分化和植株的再生；④Ti质粒不能在大肠杆菌中复制，即使得到重组质粒，也只能在农杆菌中扩增，而农杆菌的接合转化率极低（10％左右），因此，通过Ti质粒的体外操作，在常规条件下几乎不能构建在T-DNA中只有单一切点的载体；⑤Ti质粒还存在一些对T-DNA转移不起任何作用的基因。

所谓卸甲载体就是无毒的Ti质粒载体。切除T-DNA上的onc基因，即“解除”其“武装”，构建成所谓“卸甲”或称“缴械’载体（disarmedvector）。在这种载体中，已经缺失的T-DNA部位被大肠杆菌的一种常用的质粒pBR322取代。这样任何适合于克隆在pBR322质粒中的外源DNA片段，都可以通过与pBlR322质粒DNA的同源重组，而被共整合到onc-Ti质粒载体上。大肠杆菌能与农杆菌高效率地接合转移。因此，可以先将T-DNA片段克隆到大肠杆菌的质粒中，并插入外源基因，通过接合转移把外源基因引入农杆菌的Ti质粒上。带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒衍生载体称为“中间载体”，而接受中间载体的Ti质粒则称为‘受体Ti质粒”（acceptorTiplasmid），一般是卸甲载体（disarmedvector）。onc-卸甲载体7.4.1、卸甲载体对于研究外源基因在转基因植株中的表达，以及对于以改良农作物为目的的植物基因工程而言，p