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短柄草EPSP合酶基因的克隆与序列解析：开启植物遗传研究新视野

一、引言

1.1研究背景

短柄草（Brachypodium）是禾本科短柄草属植物，共有约10种，主要分布于温带和热带高山地区，我国约有6种，多分布于西南至东北地区。短柄草属中的二穗短柄草（Brachypodiumdistachyon）作为模式植物，具有诸多显著特性。它是一年生自花授粉植物，植株高度通常在15-20cm，生育期仅70-80d，这使得其生命周期短，能够在较短时间内完成世代更替，为研究提供了高效性。植株柔弱，叶片小而宽，穗子呈纺锤型且具短柄，小穗互生于穗轴上，每小穗包含2朵小花，这种独特的形态结构为植物形态学和发育学研究提供了丰富的素材。

在种植和生长特性方面，温室条件下其种植密度可达每平方米300株，每穗能收获10-12粒种子，全株可收获80-200粒种子，具有较高的繁殖效率。种子收获后需约1个月的休眠期来完成后熟代谢方可发芽，出苗后经过2周左右低温处理即可完成春化作用，且春化时间比小麦短2-3周，这一特性使其在研究植物春化作用和种子休眠机制等方面具有重要价值。同时，麦类作物白粉病菌、条锈病菌和稻类作物稻瘟病菌等均能侵染短柄草植株并引起相应症状，这使得短柄草成为研究植物与病原菌互作关系的理想材料。

短柄草还具备易于遗传转化的优势，其未成熟胚和成熟胚愈伤组织诱导率高，农杆菌介导和基因枪介导的转化体系已经建立，胚性愈伤组织分化率达90%以上，转化效率最高可达55%左右。并且，短柄草基因组小，染色体少，DNA重复序列低，获得突变体容易，突变性状容易显现，这些特性使其成为理想的模式植物，尤其是对于研究温带禾草类植物，如小麦、大麦、黑麦草等，具有不可替代的作用。通过对短柄草的研究，可以获取这些重要农作物基因组中所缺少的遗传信息和基因共线区，进而为作物基因定位、克隆、突变、测序和功能研究等提供有力支持。

5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSP合酶）在植物生命活动中扮演着关键角色。它是细菌、真菌和高等植物莽草酸途径中氨基酸合成所必需的酶，可逆地催化莽草酸-3-磷酸与磷酸烯醇式丙酮酸反应生成5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸（EPSP），并释放无机磷分子。植物、许多细菌和微生物的芳香族氨基酸及其它一些必需衍生物的生物合成都依赖于EPSP合酶，这些芳香族氨基酸参与了蛋白质、激素、色素等多种重要生物分子的合成，对生物体的生长、发育和代谢起着至关重要的作用。

然而，EPSP合酶也是除草剂草甘膦作用的靶位点。草甘膦是一种内吸传导型、广谱灭生性除草剂，自1974年在美国注册登记以来，已成为当今世界上销售量最大且使用最广的农药品种。草甘膦与磷酸烯醇丙酮酸在结构上非常相似，在莽草酸途径中，草甘膦能够占据EPSP合酶和磷酸烯醇丙酮酸的连接位点，形成EPSP合酶-s3p-草甘膦的复合物，从而使EPSP合酶催化烯醇式丙酮酸基团从磷酸烯醇丙酮酸转化到莽草酸-3-磷酸上形成EPSP的过程停止，竞争性抑制EPSP合酶的活性，进而阻断植物内辅酶q、叶酸和芳香族氨基酸等化合物的生物合成，使植物细胞分裂、叶绿素合成、蒸腾、呼吸及蛋白质等代谢受到影响，最终导致一些关键性代谢物和激素如酚类化合物和木质素代谢失调，使生物体不能进行正常的氮代谢而死亡。此外，EPSP合酶进入叶绿体的过程也受草甘膦的抑制。

由于EPSP合酶在植物抗除草剂基因工程中具有极其重要的应用价值，通过对不同植物中EPSP合酶基因的研究，能够深入了解植物对草甘膦的抗性机制，为培育抗草甘膦的转基因作物提供理论基础和基因资源。目前，获得抗草甘膦EPSP合酶编码基因的途径主要有两种：一种是从天然抗草甘膦的物种或突变体中克隆分离出抗草甘膦基因或突变基因，例如土壤农杆菌cp4-EPSP合酶基因是应用最广泛的抗草甘膦EPSP合酶基因，并已形成商业化生产；另一种是利用遗传学方法改造EPSP合酶编码基因，如定点突变技术可以减小酶与草甘膦的亲和力或提高酶与底物的亲和力，从而提高对草甘膦的抗性。

在这样的背景下，短柄草作为模式植物，其EPSP合酶基因的研究具有重要意义。通过对短柄草EPSP合酶基因的克隆及序列分析，可以为禾本科植物，尤其是麦类植物的抗除草剂研究提供新的基因资源和理论依据，有助于深入了解EPSP合酶基因在不同物种中的进化关系和功能差异，进一步推动植物抗除草剂基因工程的发展。

1.2研究目的与意义

本研究旨在从短柄草中成功分离克隆出EPSP合酶基因，并对所得的核苷酸及推导氨基酸序列展开全面深入的相似性及系统进化分析。通过这些研究，期望能够精准确定短柄草