抗卵清蛋白单克隆抗体的制备及卵清蛋白、醇溶蛋白ELISA检测方法的建立.docxVIP

抗卵清蛋白单克隆抗体的制备及卵清蛋白、醇溶蛋白ELISA检测方法的建立

一、引言

卵清蛋白作为蛋清中的主要蛋白质成分，在食品过敏检测、生物制药质量控制等领域具有重要研究价值；醇溶蛋白则是谷物中的关键储存蛋白，其检测对谷物品质评价、食品掺假鉴别意义重大。本研究以“睛”系列检测产品的技术需求为导向，通过杂交瘤技术制备高特异性抗卵清蛋白单克隆抗体，并建立灵敏、高效的卵清蛋白与醇溶蛋白ELISA检测方法，为相关领域的精准检测提供技术支撑，同时为“睛”产品的创新性应用奠定基础。

二、抗卵清蛋白单克隆抗体的制备

（一）实验材料

免疫原与试剂：卵清蛋白（纯度≥98%，Sigma-Aldrich）、弗氏完全佐剂（CFA）、弗氏不完全佐剂（IFA）、RPMI-1640培养基、胎牛血清（FBS，热灭活）、PEG1500（聚乙二醇，Sigma-Aldrich）、HAT选择培养基、HT培养基、小鼠抗IgG抗体（HRP标记）、TMB显色液、终止液（2mol/LH?SO?）。

实验动物：6-8周龄雌性BALB/c小鼠（SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司）。

细胞株：SP2/0骨髓瘤细胞（实验室冻存，复苏后经活力检测合格）。

（二）实验方法

1.动物免疫

采用分次免疫法，具体步骤如下：

首次免疫：将卵清蛋白用PBS缓冲液（pH7.4）稀释至1mg/mL，与等体积弗氏完全佐剂充分乳化，每只小鼠腹腔注射0.2mL（含卵清蛋白100μg）。

加强免疫：首次免疫后2周，将卵清蛋白与等体积弗氏不完全佐剂乳化，每只小鼠腹腔注射0.2mL（含卵清蛋白100μg），共进行2次，每次间隔2周。

冲击免疫：末次加强免疫后1周，直接腹腔注射卵清蛋白PBS溶液0.1mL（含卵清蛋白50μg），无佐剂，以增强小鼠体液免疫应答，为细胞融合做准备。

2.细胞融合

脾细胞制备：冲击免疫后3天，颈椎脱臼处死小鼠，无菌取脾脏，置于含无菌PBS的培养皿中，研磨后过200目细胞筛，收集脾细胞，用RPMI-1640培养基洗涤3次，计数备用。

骨髓瘤细胞准备：取对数生长期的SP2/0细胞，用RPMI-1640培养基洗涤2次，计数，确保细胞活力≥95%。

融合操作：按脾细胞与SP2/0细胞10:1的比例混合，在37℃水浴条件下，缓慢滴加预热至37℃的PEG1500（浓度50%），边加边轻轻搅拌，作用1min后，缓慢加入RPMI-1640培养基终止融合，离心（1000r/min，5min）后，弃上清，用含20%FBS的HAT培养基重悬细胞，均匀铺于96孔细胞培养板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO?培养箱中培养。

3.杂交瘤细胞筛选与亚克隆

首轮筛选：融合后第5天，更换为新鲜HAT培养基；第7-10天，采用间接ELISA法检测孔内细胞上清液中的抗卵清蛋白抗体。以卵清蛋白包被酶标板（1μg/孔），封闭后加入细胞上清，再加入HRP标记的小鼠抗IgG抗体，TMB显色后测定OD450值，筛选OD450值≥阴性对照3倍的阳性孔。

亚克隆：对阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆，将阳性细胞稀释至1-2个细胞/孔，铺于96孔板，培养后再次通过ELISA筛选阳性孔，重复亚克隆3-4次，直至获得能稳定分泌抗卵清蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞株。

4.单克隆抗体的大量制备与纯化

腹水制备：对筛选得到的杂交瘤细胞株，收集对数生长期细胞，调整浓度至1×10?个/mL，每只BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL，10-14天后收集腹水。

抗体纯化：采用ProteinG亲和层析柱纯化腹水中的单克隆抗体，通过SDS-PAGE电泳检测抗体纯度（要求纯度≥95%），BCA法测定抗体浓度，分装后于-80℃保存。

5.单克隆抗体特性鉴定

效价测定：通过间接ELISA法，将抗体进行梯度稀释（1:1000-1:128000），测定OD450值，以OD450值≥0.2的最高稀释度作为抗体效价，要求效价≥1:64000。

特异性鉴定：采用间接ELISA法，分别以卵清蛋白、牛血清白蛋白（BSA）、酪蛋白、大豆蛋白为包被抗原，检测抗体与各抗原的反应性，计算交叉反应率，要求与非卵清蛋白抗原的交叉反应率≤5%。

亚型鉴定：使用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒，通过ELISA法确定抗体的IgG亚型（如IgG1、IgG2a等）。

三、卵清蛋白ELISA检测方法的建立（双抗体夹心法）

（一）实验材料

自制抗卵清蛋白单克隆抗体（