除了加入4种正常的脱氧核苷三磷酸dNTP外.pptVIP

化学修饰法的待测DNA片段有的是双链，有的是单链DNA。在进行碱基特异性化学切割反应前，首先对待测DNA片段作末端标记，使其末端(5′端或者是3′端)带上放射标记。如果待测DNA是双链，必须使其形成末端标记的单链。对末端标记的DNA链进行化学断裂反应分两步进行：第一步是在4个反应管中分别以肼、硫酸二甲酯(DMS)和甲酸对特定的碱基进行化学修饰；第二步是以六氢吡啶取代被修饰的碱基并将DNA链断裂。DNA化学裂解反应体系反应体系碱基修饰试剂碱基修饰反应主链断裂试剂断裂点G硫酸二甲酯鸟嘌呤甲基化六氢吡啶GG+A甲酸脱嘌呤作用六氢吡啶G和AC+T肼嘧啶开环六氢吡啶C和TC肼（加盐）胞嘧啶开环六氢吡啶CDMS（硫酸二甲酯）在中性pH环境中，主要作用于G，被六氢吡啶作用而造成该位点上DNA链的断裂。甲酸具有脱嘌呤作用。DNA链在脱嘌呤位点(G和A)发生断裂。肼，在碱性条件下，作用于胸腺嘧啶和胞嘧啶，在具有六氢吡啶的条件下，导致在这个核苷酸位置上发生DNA链的断裂。如果在反应体系中加入高浓度的盐，同胸腺嘧啶的反应速率便会下降，主要作用于胞嘧啶。在化学修饰反应过程中，通过控制反应温度和反应时间，只有一小部分碱基被修饰(而不是全部被修饰)，随后进行的断裂反应也是定量反应。因此，DNA链并不是在所有可被修饰的碱基位点断裂，而是随机断裂。在4个反应中，产生4套带相同标记末端、长短不一的寡聚核苷酸片段。只有带标记末端的片段可被识别，没有标记末端的片段可以忽略不计。以上4种反应体系DNA片段混合物经高分辨凝胶电泳与放射自显影，便可直接读得测定DNA片段的碱基排列顺序。各DNA子片段测序工作完成后，按酶切图谱，可顺序相连完成完整的长链DNA序列。5′—GATCACTACTG—3′标记5′—*GATCACTACTG—3′G：DMSC：肼（加盐）G+A：甲酸C+T：肼5′-*GATCACTACTG5′-*GG5′-*GATCACTACTG5′-*GATCACTA5′-*GATCA5′-*GA5′-*G5′-*GATCACTAC5′-*GATCACT5′-*GATCAC5′-*GATC5′-*GAT5′-*GATCACTACT-*GATCACTACTG-5′-*GATCACTAC5′-*GATCAC5′-*GATC-*GATCACTACTG-电泳5′-*GATCACTACTG5′-*GATCACTACT5′-*GATCACTAC5′-*GATCACTA5′-*GATCACT5′-*GATCAC5′-*GATCA5′-*GATC5′-*GAT5′-*GA5′-*GC+TCGG+A5′与双脱氧链终止法相比，Maxam-Gilbert化学修饰法具有一些独到的特点。1.本法不需要体外进行酶催化的延伸反应，未经克隆的待测DNA片段也可以直接进行序列测定；2.对于含有稀有碱基如5-甲基腺嘌呤或G、C含量较高的DNA片段、短链的寡聚核苷酸的序列测定，化学修饰法较双脱氧链终止法更具优越性；（二）、Maxam-Gilbert化学修饰法的特点1.操作比较繁琐和费时，未端核素标记效率低造成放射自显影需曝光较长时间，2.对过长DNA链的序列测定仍比较困难。3.采用化学修饰法测序时，既可以标记5′末端，也可以标记3′末端，因此可以从两个相反方向测定同一条DNA链的核苷酸顺序，测定结果可以互作参照，彼此核对。主要缺点三、DNA测序自动化技术用4种不同的荧光基团分别标记4种ddNTP,这样测序反应就可以在一个试管中进行，终止反应的产物按终止位置碱基的不同，其3`末端带有不同的荧光基团，被激发后发出不同的荧光，因此可以上样在一个加样孔上，电泳结束后，用DNA测序仪识别，经软件处理，便得到待测的核苷酸序列。工作量和效率均大大提高。1、激光测序法（终止标记系统）焦磷酸测序技术（pyrosequencing）是1987年发展起来的一种新型的酶联级联测序技术，其原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶（polymerase）、ATP硫酸化酶（s