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实验方法总结（2）：细胞生物学部分

1.原代细胞分离与培养2

1.1原代细胞分离2

1.2原代细胞培养2

2.干细胞分离培养3

2.1胚胎干细胞诱导分化3

2.2肿瘤干细胞（CSC）分离鉴定4

3.细胞增殖相关研究方法7

3.1MTT分析法7

3.2XTT7

3.3WST-18

3.4CCK-8(WST-8)8

3.4平板克隆形成9

3.5软琼脂克隆形成10

3.6BrdU10

4.细胞转移相关研究方法11

4.1划痕11

4.2细胞粘附11

4.3Transwell迁移12

4.4Transwell侵袭13

5.血管生成14

6.细胞周期：PI染色14

7.细胞凋亡检测15

7.1AnnexinV/PI双染色法15

7.2TUNEL法16

7.3线粒体膜电位(MMP)检测17

8.细胞分选18

8.1流式分选18

8.2磁珠珠分选19

9.细胞转染20

10.细胞慢病毒感染20

11.基因稳定细胞株的筛选21

12.耐药细胞株的筛选22

13.细胞共培养22

13.1直接共培养22

13.2间接共培养23

1.原代细胞分离与培养

1.1原代细胞分离

人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培

养中生长繁殖，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来。

第一，悬浮细胞的分离方法

组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用

1000r/min的低速离心10min。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液

中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。

第二，实体组织材料的分离方法

对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成

细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。其中，机械分散法的

特点是简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差，适用于处理纤

维成分少的软组织。而消化分离法是指把组织剪切成较小团块（或糊状），应用

酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，

由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中

振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞

悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。

1.2原代细胞培养

原代细胞的培养也叫初代培养，是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，

是建立细胞系的第一步。

第一，组织块培养法

组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法。其基本方法是将剪

成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组

织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长。

第二，消化培养法

第三，悬浮细胞培养法。

对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌

细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层

液分离后接种培养。

第四，器官培养。

器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定

环境条件下培养。器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细胞

间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境的生物调节作用。

2.干细胞分离培养

2.1胚胎干细胞诱导分化

首先将类胚体消化成单细胞，贴壁培养，于不同的培养阶段添加不同种类和不同

浓度的化学物质、条件培养基或细胞因子等诱导条件，直接促进ES细胞定向分

化为某种特殊类型的细胞；或通过改变培养条件对某些类型的细胞分化起抑制作

用，从而高效诱导目的细胞的分化。改变细胞的培养条件使ES细胞进行定向分

化的基本策略有三种：一是向培养基中添加生长因子和化学诱导剂等；二是将ES

细胞与其它细胞一起进行培养；三是将细胞接种在适当的底物上，以促使细胞中

某些特定基因的表达上调或下降，从而引发细胞沿着某一特定谱系进行分化。

体外诱导胚胎干细胞的物质有化学试剂诱导法、细胞因子诱导法和外源基因诱

法。

化学试剂诱导法：维甲酸（RA）、DMSO、β-磷酸甘油、维生素C(VC)、

地塞米松、维生素K3(VK3)以及2，5-羟基维生素D3等化学试剂，都能诱