蛋白检测篇6-双向凝胶电泳.pdfVIP

编号：1-6

主题：双向凝胶电泳

概述：

双向凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术（根据蛋白质等电点进行分离）以及SDS

－聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（根据蛋白质的大小进行分离）。这两项技术结合形

成的二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。

目的：

凝胶中蛋白的检测、图像采集和分析、蛋白鉴定、分离蛋白质组所有蛋白。

原理：

1、根据蛋白质的等电点（第一向）和分子量（第二向）的不同进行分离。

蛋白质是两性分子，在不同的pH环境中可以带正电荷、负电荷或不带电荷。

对每个蛋白质来说都有一个特定的pH，此时蛋白质的静电荷为零，此pH值即

该蛋白质的等电点(pI)。将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，它会

向与其所带电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，蛋白分子可能获得或失去

质子，并且随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白质迁

移至其等电点pH位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。聚焦是一个与

pH相关的平衡过程：蛋白质以不同的速率靠近并最终停留在它们各自的pI值；

在等电聚焦过程中，蛋白质可以从各个方向移动到它的恒定位点。

双向电泳的第二向是将IPG胶条中经过第一向分离的蛋白转移到第二向

SDS．PAGE凝胶上，根据蛋白相对分子质量或分子量(MW)大小与第一相垂直

的分离。蛋白质与十二烷基硫酸钠(SDS)结合形成带负电荷的蛋白-SDS复合物，

由于SDS是一种强阴离子去垢剂，所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电

荷量，能消除不同分子之间原有的电荷差异，从而使得凝胶中电泳迁移率不再受

蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质分子的质量大小，其迁移率与分子

量的对数呈线性关系。

步骤：

１.样品制备

２.第一向分离等电聚焦

３.第二向分离聚丙烯酰胺凝胶电泳

３.修饰和加工，如用32P标记可以研究磷酸化蛋白的变化

流程图：