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编号：1-9

主题：荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET)

概述：

荧光共振能量转移（fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET）作为

一种高效的光学“分子尺”，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方

面有广泛的应用。在分子生物学领域，该技术可用于研究活细胞生理条件下蛋白

质-蛋白质间的相互作用。蛋白质-蛋白质间相互作用在整个细胞生命过程中占有

重要地位，由于细胞内各种组分极其复杂，因此一些传统研究蛋白质-蛋白质间

相互作用的方法如酵母双杂交、免疫沉淀等可能会丢失某些重要的信息，无法正

确地反映在当时活细胞生理条件下蛋白质-蛋白质间相互作用的动态变化过程。

FRET技术是近来发展的一项新技术，为在活细胞生理条件下对蛋白质-蛋白质间

相互作用进行实时的动态研究提供了便利。

目的：

1.活细胞内检测蛋白激酶活性；

2.细胞凋亡的研究；

3.受体激活效应在细胞膜上的横向扩散；

4.膜蛋白的定位修饰；

5.细胞膜受体之间相互作用；

6.细胞内分子之间相互作用。

原理：

荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频

率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作

用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。FRET是一种非

辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激

发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏

化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延

长。能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受

体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。作为共振能量转

移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件：

①受、供体的激发光要足够分得开；

②供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。

步骤：

1、实验所用细胞的培养；

2细胞转染质粒：CFP-A基因和YFP-B基因质粒；

3多光子共聚焦显微镜和FRET观察

FRET检测时间：CFP-A基因或YFP-B基因转染细胞12h、18h、24h、36h、

48h、72h后检测FRET。

FRET图像采集：确定FRET配对的激发波长，蓝宝石激光被调谐分别用于探测

最大和最小的供体和受体信号，最大供体信号和最小受体信号对应的波长用于

收集双表达细胞的FRET信号。标定CFP（供体）和YFP（受体），调整激

光变化，以便获取最大CFP信号和最小YFP信号的激发光波长，以此激发

（CFP-YFP）双表达细胞，选择合适的滤镜组合和高灵敏的PMT，采集供体和

受体图像，收集FRET信号，调整供体激光强度，固定用于激发供体，对受体激

发波长也类似要求，注意调整能量，使用合适的中性密度滤光片，避免光漂白。

每个细胞FRET检测重复3次，每种转染至少完成6个细胞的FRET检测。

FRET数据处理：去除FRET信号中DSBT和ASBT的光谱串色信号；受体通

路的

FRET信号需要对供体受体光谱灵敏度的变化进行矫正、对自发荧光和光学噪声

进行矫正；利用矫正系数对双标定细胞进行象素匹配矫正。