蛋白检测篇4-免疫共沉淀（Co-IP）.pdfVIP

编号：１－４

主题：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）

概述：

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一种以抗体和抗原之间的

特异免疫反应为基础，研究蛋白质与蛋白质间相互作用的经典方法。其基本原理

是在细胞裂解液中加入抗原特异性的抗体，抗体、抗原、以及与抗原具有相互作

用的蛋白质通过抗原与抗体之间免疫沉淀反应将形成免疫复合物，经过纯化，洗

脱，收集免疫复合物，SDS电泳，westernblot和（或）质谱可鉴定出

与抗原相互作用的蛋白质。其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰

的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为

的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能

检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可

能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测

目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到

结果，方法本身具有冒险性。

目的：

研究一种已知蛋白质与已知或者未知蛋白质间相互作用

原理：

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相

互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合

的蛋白质Y也能沉淀下来。

步骤：

1.用RIPA裂解缓冲液裂解细胞；

2.用PBS配制成50%的proteinA/G-agarose工作液；

3.在样品中以每1ml中加100μl的比例，加入50%的ProteinA/Gagarose工

作液。水平摇床4℃摇动10min（该步骤的目的是去除非特异性结合的蛋白）；

4.4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除protein

A/G-agraose微球；

5.使用BCA法或者其他方法测定总蛋白的浓度；

6.加入一定体积的一抗；

8.用摇床缓慢摇动抗原抗体混合物，4℃过夜；

9.14000g离心收集沉淀，并且用预冷的洗涤缓冲液（或者预冷的PBS）洗涤3

遍；

10.收集上清，用于进一步的下游SDS、western-blot或者质谱分析。

流程图：