狂犬病RTPCR检测操作规程.docxVIP

狂犬病病毒巢式反转录-聚合酶链式反应检测(RT-PCR)

1样品采集、保存及运输

1.1采集部位取待检动物的脑组织。

1.2采集方法对大动物（如犬、猫、牛等）的脑组织标本的采集使用快速采样法，即：用塑料管从头部枕骨大孔或能看见脑组织的位置向眼眶处斜插（或用粗穿刺针从眼角眶向头部枕骨大孔处斜插），然后阻断塑料管尾部与外界大气压强连通，迅速将塑料管拔出。尽量使塑料管通过犬脑的大脑、中脑和小脑部位。取出的塑料管中应有脑组织；将脑组织标本放入无菌离心管中，记录编号后保存备用。

1.3样品保存所有狂犬病标本在2～8℃保存应不超过24小时；在-20℃冰箱冷冻保存应不超过6个月；长期保存时，以-70℃或-80℃冰箱为易。冰冻保存要避免反复冻融，最多冻融3次。

1.4样品运输标本一定要放置在有干冰或冰块的冷藏包中，保持全程冷链运输。要求在运输至实验室时，干冰仍覆盖标本或冰仍未完全融化。

2样品处理

2.1组织样品处理分别从待检脑组织脑干、小脑及海马回三个不同的部位各称取样品约1g，用手术剪剪碎混匀，再取1g于研磨器中研磨，加入1mL生理盐水继续研磨，取100μL匀浆液于1.5mL灭菌离心管中。

2.2阳性对照处理取阳性对照100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

2.3阴性对照处理取阴性对照100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

3病毒RNA的提取

3.1取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600μL，充分颠倒混匀，室温静置3～5min。

3.2将液体吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时堵塞吸附柱），13000rpm离心30s，弃去收集管中液体，套上收集管。

3.3向吸附柱中加入600μL洗液，13000rpm离心30s，弃去收集管中液体，套上收集管。

3.4重复步骤2.3。

3.5再空柱13000rpm离心2min。

3.6将吸附柱移入新的1.5mL离心管中，在膜中央悬空加入洗脱液50μL，室温静置1min，13000rpm离心30s，获得总RNA。

4扩增操作

4.1RT-PCR扩增设被检样品、阴性对照和阳性对照的份数总和为N，按如下反应体系配制：

RT-PCR反应液22×（N+1）μL

酶混合液3×（N+1）μL

将以上配制的反应体系充分混匀后，分装至每个反应管中各25μL。

分别取5.2.6中已溶解的病毒RNA25μL加入相应反应管中，做好标记。在PCR扩增仪上进行以下反应，反应程序为：50℃30min，95℃3min；扩增条件为95℃40s，56℃45s，72℃90s，35个循环；72℃延伸5min。

4.2PCR扩增将PCR反应液分装至每管中各27μL，每管分别加入22μL无核酸酶水和1μLRT-PCR扩增产物（5.4.1的扩增产物），做好标记。在PCR扩增仪上进行以下反应，反应程序为：95℃3min；扩增条件为95℃40s，56℃45s，72℃30s，35个循环；72℃延伸5min。

5电泳将PCR扩增产物10μL点样于1%琼脂糖凝胶孔中，以110～120V电压于1倍TAE缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果。

6结果判定阳性对照出现255bp扩增带、阴性对照无带出现（引物带除外）时，实验结果成立。被检样品出现255bp扩增带为狂犬病病毒阳性，否则为阴性。

【注意事项】

1狂犬病样品的采集应由专业的技术人员完成，以免因样品采集不当而影响实验结果，鉴于待检病料可能含有感染性病毒，要求检验人员必须接受狂犬病暴露前免疫。

2所有用于检测的废弃物品均应放入含消毒液的废物缸内，高压灭菌处理。

3实验室应分配液区、模板提取区和扩增区。工作流程顺序为配液区→模板提取区→扩增区。各区器材试剂专用，不可跨区使用。实验结束后立即用1%次氯酸钠或75%酒精消毒工作台。

4所有试剂应在规定的温度下保存，酶混合液应置于冰盒上使用，其余冷冻保存的试剂使用前应拿到室温融化，再3000rpm离心15s，使液体全部沉于管底。用毕所有试剂立即放回原处。

5在提取RNA时，尽量缩短操作时间，避免RNA酶污染。离心管、吸头等在实验前应全部高压灭菌。用灭菌的镊子夹取离心管，打开和盖上离心管盖时避免手和手套接触离心管口，若离心管开盖时粘在手上或溅出，应立即更换手套；所有接触病料的物品均应合理处理。

6提取的RNA样品，短期内使用放置于2~8℃或冰上，长期应在-70℃保存。

7反应体系在特定配液区或者超净工作台中配制，配制和分装RT-PCR反应液、PCR反应液时应尽量避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧。