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浸没式培养

自20世纪80年代中期开始，西方国家开始了大规模液体浸没组织培养的研究，到90年代中后期取得了突破性进展，为商业化生产苗木打下了坚实的基础。国内研究起步晚，且主要集中在次生代谢产物的生产上，目的在于降低成本。目前，实现苗木商业化生产的大规模组织培养研究尚未有报道。间歇浸没式繁殖效率高，成本低，在林木育种方面具有巨大的应用潜力。

1.间歇式浸没式培养系统概述

目前，常用的半固体培养劳动力密集，成本高；而液体培养虽然具有更多特点适应大规模生产，降低成本，但是玻璃化畸形等生理问题比较严重。因此,2种方法都无法实现提高效率和降低成本的市场化要求。因此，改善培养工艺，建立新的培养方法体系，减少劳动力耗费，实现自动化培养是降低成本实现商业生产的一种趋势。最早使用微生物发酵罐来进行植物组织培养，但是由于成本以及植物的特点的限制而失败。针对植物组织培养的特点，经过30年的简化和完善，出现了多种专用于植物组织培养生物反应器，如筏式生物反应器，喷雾式生物反应器等。其中间歇浸没培养应用最为广泛，包括完全浸没间歇培养和半浸没间歇培养。间歇浸没式生物反应器有多种类型，在这些生物反应器中比较成熟的，具有代表性的主要有以下几种。

（1）APCS间歇完全浸没培养系统。最早的间歇式浸没系统出现在1985年，由Tisserat和Vandercook设计了植物自动培养系统，简称APCS为系统。整个系统有4个部分组成：营养液储存系统有2个营养蓄水池组成；营养液驱动系统由2个叶轮推动器组成；植物培养系统是1个大的玻璃培养腔；营养液运输系统由硅胶树脂管组成。整个系统在叶轮驱动下实现了液体的定期补充和排干，获得了与手工培养同样的效果，却没有了繁琐的更新操作。APCS系统培养的兰花芽尖的数量是半固体培养的芽尖数量的4倍，而且其中的植物生长更快更好。该系统培养明显减少了劳动消耗。

（2）蠕动泵驱动间歇半浸没培养系统。20世纪80年代末，Aitken.Christie等改进了APCS系统，形成了1套半自动培养系统，该系统使用了1个巨大的聚碳酸酯培养容器（250mm×390mm×120mm）。在培养容器内，辐射松首先在固体培养基上培养1个月，然后利用蠕动泵和定时器达到营养液的自动化间歇更新，最终实现了对辐射松的间歇半浸没培养。液体更新每次30～40ml，需6～7h，每周2次。在供给营养液的时候，注意保持气体供应，保证苗的需氧量，通气培养比不通气培养效果好。

在此基础上，1991年，Simonton等设计了1套计算机控制泵实现液体间歇供应的系统，有4个培养容器，用带孔聚丙烯作为支撑代替琼脂培养基，这样能够控制营养液的高度，使营养循环能够按照预定设计进行。上述3种培养系统都是采用了外界机械动力作为驱动力，利用控制程序实现营养液的间歇供给和排干，减少了劳动力耗费，降低了成本。但是由于营养周期长，操作复杂，污染和空间限制问题比较严重。

（3）气泵驱动RITA间歇浸没式生物反应器。1993年，Ralvard等设计了一套间歇浸没控制系统，该系统有2个容器组成，下面的是营养液储存容器，上面是培养容器。中间有管道相连，利用气压泵产生的气压作为动力，迫使培养液从营养液储存容器通过中心管道流入培养容器，与整个培养物的完全接触，同时引起气体流动，实现培养容器空气的更新。气体进入营养液储存器时，都经过22um的滤膜防止污染。系统进入市场后正式命名为TheRecipientforAutomatedTemporaryImmersionsystem，简称为RITA(图8-7)。应用该系统通过多种培养方式对香蕉培养，发现间歇浸没培养的繁殖率最高，为其他培养方法的2～3倍，干重是其他培养方法的2～5倍，整个系统简单易用。1995年已经投入市场，实现了多个植物物种的大规模。但是系统容器体积小，构造复杂，价格较贵，这些都限制了这套培养控制系统在发展中国家的推广应用。

图8-7半自动浸没式培养装置RITA完全浸没植株材料、更新液体培养基装置

图8-7半自动浸没式培养装置RITA

完全浸没植株材料、更新液体培养基装置

（4）BIT间歇浸没式生物反器。在RITA设计的基础上，Escalona等设计了2个容器分开的气体驱动间歇浸没生物反应器，称为TheTwinFlasksystem，商品为BIT（图8-8）。培养容器的大小可以改变，而且构造简单，价格便宜。2个容器通过玻璃管或者硅管连接，气体通过0.2um的滤膜除菌；使用了2个空气压缩机来实现营养液的供给和排干。使用该系统，以2min/3h的浸没频率供给营养，

图8-8表示半自动浸没式培养装置BIT。

图8-8表示半自动浸没式培养装置BIT。

一对烧瓶完全浸没植株材料、不更新液体培养基的装置

同时也完成了气体更新