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抗卵清蛋白单克隆抗体制备及卵清蛋白、醇溶蛋白ELISA检测方法的构建与验证

一、引言

1.1研究背景与意义

在全球范围内，食物过敏已成为一个日益严峻的公共卫生问题。据统计，过敏性疾病影响着全世界近1/4的人口，其中3‰-5%为食物过敏，被世界卫生组织列为21世纪重点防治的三大疾病之一。美国疾病控制和预防中心估计，全美有5000多万人患有过敏症状，在全体美国人中，有10.8%的成年人有食物过敏，6.5%的18岁以下儿童患有食物过敏。在食物过敏的成年人中，51.1%的人有严重反应，食物过敏儿童的这一数据为42.3%，全美每年因该症状产生的额外支出高达248亿美元。英国有7%儿童受食物过敏影响，澳大利亚有9%，全欧洲有2%的成年人对特定食物过敏。

食物过敏不仅严重影响患者的生活质量，如美国加州洛杉矶21岁女子詹娜?格斯特纳被诊断出患有肥大细胞活化综合征，对100多种食物过敏，日常饮食和外出就餐都面临极大挑战，还可能导致严重的健康问题，在严重情况下会出现呕吐、腹泻、呼吸困难与过敏性休克，甚至危及生命。常见的食物过敏原包括牛奶、鸡蛋、花生、坚果、芝麻、鱼类以及贝类等，其中卵清蛋白作为鸡蛋的主要蛋白质，是鸡蛋的主要过敏原之一；醇溶蛋白约占小麦种子贮藏蛋白总量的40%，是小麦等谷物类的主要过敏原。准确检测食品中的卵清蛋白和醇溶蛋白，对于预防食物过敏反应的发生、保障消费者的健康具有重要意义。

在食品检测领域，目前国内外对常见的8大类过敏原（蛋、奶、大豆、花生、小麦、树果、鱼和贝类）检测，缺乏相应的标准和方法。酶联免疫吸附测定（ELISA）方法因具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，成为食品过敏原检测的主流技术之一。本研究致力于制备抗卵清蛋白单克隆抗体，并建立卵清蛋白、醇溶蛋白的ELISA检测方法，旨在填补相关检测标准和方法的空白，为食品生产、加工和流通环节的过敏原检测提供可靠的技术手段，有助于降低食品过敏风险，为食品安全监管提供有力支持，为消费者提供更加安全、可靠的食品选择。

1.2国内外研究现状

在抗卵清蛋白单克隆抗体制备方面，国内外学者已开展了大量研究。国外早在多年前就利用杂交瘤技术进行抗卵清蛋白单克隆抗体的制备尝试，通过将免疫后的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞，进而筛选出分泌特异性抗体的细胞株。国内相关研究也在不断跟进，一些研究团队通过优化免疫方案、细胞融合条件以及筛选方法，成功制备出了特异性和亲和力较高的抗卵清蛋白单克隆抗体。例如，有研究将高纯度卵清蛋白免疫8周龄的BALB/c小鼠，经多次免疫后取脾细胞与SP2/O骨髓瘤细胞经PEG融合，通过间接ELISA和有限稀释法筛选，获得了多株分泌抗卵清蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

在卵清蛋白和醇溶蛋白ELISA检测方法的建立上，国外已建立了多种基于ELISA的检测技术，如双抗体夹心ELISA法、竞争ELISA法等，用于检测食品中的卵清蛋白和醇溶蛋白含量，并且部分检测试剂盒已实现商业化生产。国内也在积极探索适合我国国情的检测方法，通过改进包被抗体、酶标抗体以及优化检测条件等方式，提高检测方法的灵敏度和特异性。然而，当前研究仍存在一些不足。一方面，现有的抗卵清蛋白单克隆抗体在稳定性和亲和力方面还有提升空间，部分抗体在长期保存或复杂检测环境下，其活性和特异性会有所下降。另一方面，已建立的ELISA检测方法在检测复杂食品基质中的卵清蛋白和醇溶蛋白时，容易受到基质干扰，导致检测结果的准确性和重复性欠佳。此外，针对不同来源和处理方式的食品样品，检测方法的通用性和适应性有待进一步提高。本研究将针对这些不足，从单克隆抗体制备的关键环节入手，优化抗体性能，并通过深入研究ELISA检测条件和样品前处理方法，提高检测方法的准确性、重复性和通用性。

1.3研究内容与目标

本研究的首要任务是制备抗卵清蛋白单克隆抗体。首先进行重组卵清蛋白的表达及纯化，将卵清蛋白基因克隆到表达载体pET30a(+)中，转化BL21(DE3)E.coli细胞，经IPTG诱导表达，随后使用Ni-NTA亲和层析进行纯化，以获取高纯度重组卵清蛋白。接着，将高纯度重组卵清蛋白注射到BALB/c小鼠体内，进行抗原的免疫，之后制备融合细胞，通过细胞融合和限制性稀释法，筛选并获得稳定的单克隆抗体细胞株。最后，利用免疫印迹和ELISA方法检测抗体的特异性和亲和力，筛选出特异性和亲和力较高的单克隆抗体细胞株，并对单克隆抗体进行分离提纯。

在建立卵清蛋白、醇溶蛋白ELISA检测方法方面，以高纯度的卵清蛋白和醇溶蛋白分别作为抗原，将其吸附到ELISA检测板上，加入不同浓度的样品和制备好的单克隆抗