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分子生物学中心实验室操作指南

演讲人：

日期:

01

实验室安全规程

02

仪器操作指南

03

DNA/RNA处理技术

04

PCR与放大方法

05

电泳与分析流程

06

数据记录与质量管理

目录

CATALOGUE

实验室安全规程

01

PART

个人防护装备要求

实验服与护目镜

实验人员必须穿戴专用实验服，确保覆盖手臂和躯干，并佩戴护目镜以防止化学飞溅或生物样本接触眼睛。实验服需定期消毒或更换，避免交叉污染。

手套选择与更换

根据实验类型选择合适材质的手套（如丁腈手套防化学腐蚀，乳胶手套防生物污染），操作高风险样本时需双层手套防护，且每完成一项操作后立即更换。

呼吸防护设备

处理挥发性试剂或气溶胶生成实验时，必须佩戴N95口罩或正压呼吸面罩，确保过滤效率符合国际标准，并定期检查密封性。

BSL-1基础防护

针对潜在致病性病原体（如流感病毒），需在生物安全柜内操作，实验室入口设置警示标识，所有人员必须接受专项培训并接种相关疫苗。

BSL-2中等防护

BSL-3严格防护

涉及高致病性病原体（如结核杆菌）时，实验室需负压设计，空气经HEPA过滤后排放，实验人员需穿戴正压防护服并实施双人操作制度。

适用于已知无致病性的微生物实验，要求实验区域与公共区域隔离，配备基础消毒设施（如紫外线灯、洗手液），实验废弃物需经高压灭菌处理。

生物安全级别标准

应急响应程序

化学品泄漏处理

立即启动通风系统，使用吸附材料（如活性炭或硅胶）覆盖泄漏区域，避免直接接触。腐蚀性液体泄漏时需穿戴防酸围裙，并按MSDS指南中和处理。

设备故障与火灾

关闭电源后使用二氧化碳灭火器扑灭明火，严禁用水灭火。离心机超速故障时需等待转子完全停止后，由专业人员检查转子完整性。

生物样本暴露应急

皮肤或黏膜接触病原体后，需用大量生理盐水冲洗15分钟，并报告安全专员启动暴露后预防（PEP）流程，包括医学评估与隔离观察。

仪器操作指南

02

PART

离心机使用规范

离心前必须确保转子内对称位置的样本管重量误差不超过0.1克，避免因不平衡导致转子损坏或设备异常震动。使用前需检查离心管材质是否适配当前转速等级。

平衡对称放置样本

根据样本密度差异选择适当转速和离心时间，对于细胞分离建议采用渐进加速模式，核酸沉淀需保持恒定高速离心。所有参数需记录在设备使用日志中。

梯度离心参数设置

如发现异常震动或噪音，应立即切断电源并启动手动制动阀。严禁直接打开离心机盖，待转子完全静止后，由专业人员检查转轴和转子卡槽状态。

紧急制动操作流程

微量移液器校准步骤

多通道一致性验证

对8通道及以上移液器，需平行检测所有通道的移液精度，通道间CV值应＜2%。校准数据需上传至实验室管理系统存档。

活塞系统维护

每月拆卸活塞组件进行硅脂润滑，检查O型环密封性。发现液体渗入活塞腔体时，需立即更换密封组件并重新校准。

重力法校准操作

使用分析天平称量蒸馏水转移量，在标准温湿度条件下，10μL移液器连续10次移液误差应≤±1%。校准需覆盖量程的20%、50%和100%三个关键点。

PCR仪设置参数

热盖压力调节标准

根据反应管类型调整热盖压力，0.2mL薄壁管需施加30-40N压力确保管壁与模块充分接触。压力不足会导致温度传导效率下降10-15%。

梯度PCR温度验证

运行前需用校准模块验证各孔位温度一致性，96孔板边缘与中心孔温差应≤±0.3℃。温度斜坡速率设置需考虑酶活性保持范围。

荧光校正程序执行

每月进行ROX参比荧光校正，包括基线扣除、增益调节和光谱补偿。多色检测时需单独设置各荧光通道的采集窗口和阈值。

DNA/RNA处理技术

03

PART

样品提取基础步骤

组织破碎与裂解

使用液氮研磨或机械匀浆法破碎组织样本，加入裂解缓冲液（如含SDS或蛋白酶K的溶液）充分裂解细胞膜和核膜，释放核酸。

02

04

03

01

核酸沉淀与洗涤

加入异丙醇或乙醇沉淀核酸，离心后弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀以去除盐分和残留试剂，提高纯度。

去除蛋白质与杂质

通过苯酚-氯仿抽提或硅胶膜吸附法分离核酸与蛋白质，离心后保留水相中的DNA/RNA，避免有机相污染。

溶解与保存

将沉淀溶于无核酸酶的超纯水或TE缓冲液，分装后于-80℃长期保存或-20℃短期保存，避免反复冻融。

用平衡缓冲液预处理硅胶柱，确保膜结合能力一致；将裂解液与结合缓冲液混合后上柱，离心使核酸特异性吸附于膜上。

依次用高盐缓冲液和乙醇基洗涤液去除蛋白质、多糖等杂质，离心后弃废液，避免膜干燥影响回收率。

使用预热的低盐洗脱缓冲液（如pH8.0的Tris-HCl）离心洗脱核酸，洗脱体积需根据下游应用调整（通常为30-100μL）。

记录每批次试剂的批号、操作时间及操作人员，定期验证试剂盒性能，防止批次差异影响实验结果。

纯化试剂盒操作要点

柱平衡与上样

杂