副结核分枝杆菌hsp65基因的克隆、表达与免疫特性研究.docxVIP

副结核分枝杆菌hsp65基因的克隆、表达与免疫特性研究

一、引言

1.1副结核病概述

副结核病（Paratuberculosis），又称Johne’s病，是一种极具危害性的慢性传染病，其病原体为副结核分枝杆菌，即禽分枝杆菌副结核亚种（Mycobacteriumaviumsubsp.Paratuberculosis，MAP）。这种细菌呈革兰氏阳性，具有抗酸染色特性，形态上表现为长0.5-1.5um，宽0.3-0.5um的小杆菌，在组织和粪便中常排列成团或成丛。其生长特性较为特殊，初次分离培养困难且耗时久，需在添加一定量甘油和非致病性抗酸菌浸出液的培养基中，才有助于其生长，并且对热和消毒药的抵抗力与结核杆菌相似。

副结核病主要侵袭反刍动物，如牛、羊、骆驼、鹿等，其中牛尤其是乳牛感染最为常见，幼年牛对其高度易感。在病畜体内，副结核杆菌主要定位于肠黏膜和肠系膜淋巴结。患病家畜，包括无症状的隐性感染个体，会通过粪便大量排出病原菌，这些病原菌在外界环境中抵抗力较强，可存活数月之久，进而污染饮水、草料等，健康畜通过消化道摄入被污染的物质而感染。部分病例中，病原菌还可能侵入血液，随乳汁和尿排出体外，甚至可通过子宫传染给犊牛，皮下或静脉接种也能使犊牛感染。

该病的潜伏期可长达6-12个月甚至更久，一般在动物2-5岁时才出现临床症状，母牛在怀孕、分娩及泌乳期更易发病。其临床症状主要表现为顽固性腹泻，排泄物稀薄、恶臭，带有气泡、黏液和血液凝块；病畜食欲逐渐减退，精神萎靡，经常躺卧，泌乳减少直至停止；身体逐渐消瘦，眼窝下陷，皮肤粗糙，被毛粗乱，下颌及垂皮出现水肿，体温通常无明显变化。尽管病畜消瘦，但性欲可能依然存在，腹泻还会间歇性发作，给予多汁青饲料可能加剧症状，若腹泻不止，病畜一般在3-4个月因衰竭而死亡，染疫牛群的死亡率每年可高达10％。剖检可见病畜尸体消瘦，主要病变集中在消化道和肠系膜淋巴结，空肠、回肠和结肠前段，特别是回肠常出现肠壁增厚，浆膜下淋巴管和肠系膜淋巴管肿大呈索状，浆膜和肠系膜显著水肿，肠黏膜增厚3-20倍，形成硬而弯曲的皱褶，色黄白或灰黄，皱褶突起处充血，附有黏稠混浊黏液，无结节、坏死和溃疡，肠腔内容物少，肠系膜淋巴结肿大变软，切面浸润，有黄白色病灶但无干酪样变。

副结核病呈世界性分布，严重威胁着畜牧业的发展。在美国，至少22%的牛场中有超过10%的牛感染MAP，受感染奶牛群每头奶牛每年经济损失估计为21-79美元，1996年因MAP感染导致奶牛产奶量减少造成的经济损失达(2±1.6)亿美元；在澳大利亚、加拿大、法国和英国的奶牛群中，每头奶牛每年经济损失分别约为45-88澳元、49加元、234欧元和27英镑。在英国，副结核病对绵羊业造成的经济损失估计每年在40万-3200万英镑；MAP感染使意大利奶羊场的利润效率从84%降至64%。此外，副结核病还与人类健康密切相关，从副结核病牛与克罗恩病人肠道感染症状的相似性，以及在50%以持续性腹泻为特征的克罗恩病患者血液中可分离出副结核病病原来看，它具有潜在的人兽共患传染病风险，对公共卫生意义重大。我国1953年在内蒙古首次发现副结核病，随后在黑龙江、吉林、河北等地均有暴发，几乎覆盖北方大部分地区。近年来的检测数据显示，国内部分地区规模化牧场中的牛MAP抗体阳性率存在差异，如2015年内蒙古为2.09%、黑龙江省为3.90%、湖北省为2.05%等。

1.2副结核分枝杆菌hsp65基因研究背景

热休克蛋白（HeatShockProteins，HSPs）是生物体在受到物理、化学、生物、精神等多种刺激时，发生应激反应而合成的一类高度保守的蛋白质，在正常生理条件下表达量较低，应激时表达量显著升高，因此也被称为应激蛋白。根据分子量的不同，主要的热休克蛋白可分为5个家族，分别是大分子量家族、HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族和小分子量家族。这些家族在细胞的正常生理功能维持以及应对各种应激条件时，都发挥着不可或缺的作用。

Hsp60作为HSP60家族的重要成员，是一种分子伴侣。在细胞内，当蛋白质受到各种因素影响而发生变性，形成不可溶的凝聚状态时，Hsp60能够与这些变性蛋白相互作用，通过一系列复杂的生化过程，协助它们重新恢复天然的构象，确保蛋白质能够正常行使其生物学功能。在许多病原体的传染过程中，Hsp60因其独特的结构和免疫原性，成为免疫优势抗原。当病原体入侵宿主时，宿主免疫系统会识别病原体表面或释放的Hsp60，进而启动免疫应答反应，试图清除病原体。

hsp65基因，又名groEL2基因，其编码的蛋白属于