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酿酒酵母菌株改造：高产C6-C10乙基酯之路

一、引言

1.1研究背景与意义

酒，作为一种历史悠久且深受人们喜爱的饮品，其独特的风味是吸引消费者的关键因素。酒的风味由多种物质共同构成，包括醇类、酸类、醛类和酯类等，这些风味物质的种类、含量以及它们之间的相互作用，共同决定了酒的香气和口感特征。其中，酯类物质是酒中重要的香气成分，对酒的风味起着至关重要的作用。较高的酯含量不仅赋予酒独特的酯香，还能有效地扩张、松弛神经，减少喝酒引起的副作用。不同的酯类具有各自独特的香气，如乙酸乙酯具有清爽的果香，类似苹果、梨等水果的香气，在清香型白酒中含量相对较高，使得清香型白酒香气清新、纯正；己酸乙酯具有浓郁的果香，类似菠萝、香蕉的香气，是浓香型白酒香气的重要构成成分，含量较高时能赋予白酒浓郁醇厚的香气。

C6-C10乙基酯，即己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯，是所有香型中国白酒的重要呈香物质，尤其是浓香型白酒和葡萄酒的特征芳香性物质。己酸乙酯具有菠萝香气味，辛酸乙酯具有苹果香气味，癸酸乙酯具有脂肪酸气味。在优质浓香型白酒中，己酸乙酯的含量通常为0.4-2.2g/L；在优质白兰地中，C6-C10乙基酯的含量均为0.300mg/L左右。然而，由于酿酒酵母自身缺乏相应的酰基CoA，以及缺乏特异性强的醇酰基转移酶，导致中链乙基酯的合成量很低。同时，与乙酸酯相比较，乙基酯不容易分泌到发酵液中，且容易挥发，各种因素使得乙基酯被检测到的含量一般都极为微量。

提升C6-C10乙基酯这类典型的特征香气物质的含量，对于提高各类酒的品质、改善其风味具有关键作用。大多数以纯种培养的酿酒酵母为主体微生物进行的发酵，虽然具有发酵周期短、原料出酒率高的特点，但由于酿酒酵母产酯香物质的能力极低，致使成品酒品质较差。高档饮料酒中酯香物质含量较高，主要是因为采用微生物制曲发酵，其中汉逊酵母和假丝酵母等产乙酸乙酯能力较强，而产C6-C10乙基酯则是根据酯化反应原理，利用梭菌、乳酸菌、己酸菌和霉菌等生香微生物来提高酒中酸，与乙醇缓慢反应生成C6-C10乙基酯。但这些天然的产酯酵母和提供酯前体的微生物存在一些问题，一方面，它们不具备高效产C6-C10乙基酯的能力；另一方面，野生菌群的存在严重影响了原料出酒率，使酒精发酵效率不到酿酒酵母的三分之一，导致高档酒耗粮高、生产周期长、效率低、成本高。

因此，构建高产C6-C10乙基酯酿酒酵母菌株具有重要的应用价值。通过基因工程技术对酿酒酵母进行改造，使其在发酵过程中既能保持优良的酒精发酵特性，又能生产基础酯香物质C6-C10乙基酯，这对于白酒和葡萄酒产品风味特征的维持与强化、质量的提高与稳定，乃至发酵工艺的改革都具有重要意义。它不仅有助于提升酒的品质，满足消费者对高品质酒的需求，还能为酿酒行业带来更高的经济效益和市场竞争力。

1.2C6-C10乙基酯研究进展

1.2.1产C6-C10乙基酯的微生物及其应用

目前，已发现多种微生物能够产生C6-C10乙基酯。在白酒酿造中，梭菌、乳酸菌、己酸菌和霉菌等生香微生物可通过与乙醇的酯化反应生成C6-C10乙基酯。例如，己酸菌能够利用糖类等物质产生己酸，己酸再与乙醇反应生成己酸乙酯，己酸乙酯是浓香型白酒的主要香气成分之一。在葡萄酒酿造中，酿酒酵母是主要的发酵微生物，但野生型酿酒酵母产C6-C10乙基酯的能力较低。近年来，也有研究关注非酿酒酵母在产酯方面的潜力，如某些毕赤酵母、汉逊酵母等在特定条件下也能产生一定量的酯类物质，包括C6-C10乙基酯。

然而，这些天然产C6-C10乙基酯的微生物存在一些局限性。一方面，许多微生物虽然能产生C6-C10乙基酯，但其产量较低，难以满足工业生产对高品质酒中酯含量的要求。另一方面，一些微生物在发酵过程中会产生其他副产物，影响酒的风味和品质。例如，野生菌群的存在可能导致发酵过程不稳定，产生异味物质，降低酒的质量。此外，利用这些微生物进行发酵时，往往需要复杂的发酵条件和较长的发酵周期，增加了生产成本。

1.2.2C6-C10乙基酯的生成途径

C6-C10乙基酯的生成主要通过酯化反应，即酸和醇在酶的催化下反应生成酯和水。在微生物发酵过程中，该反应主要由醇酰基转移酶（AAT）催化。以酿酒酵母为例，其细胞内的乙酰辅酶A在一系列酶的作用下，经过脂肪酸合成途径生成中链酰基辅酶A，中链酰基辅酶A再与乙醇在醇酰基转移酶的催化下生成C6-C10乙基酯。

具体来说，乙酰辅酶A是脂肪酸合成的起始物质，它在乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的作用下，生成丙二酸单酰辅酶A。丙二酸单酰辅酶A和乙酰辅酶A在脂肪酸合成酶（FAS）的催化下，经过多次缩合、还原