纯化水微生物薄膜过滤法的操作流程.docxVIP

一、实验前准备

仪器与耗材

薄膜过滤器（无菌，孔径0.45μm或0.22μm）

真空泵或手动抽滤装置

无菌镊子、无菌培养皿、无菌吸管或移液器

R2A琼脂培养基（用于纯化水微生物培养，需预灭菌）

样品处理

纯化水样品需在取样后2小时内检测，或按标准冷藏保存（2-8℃,≤24h）。

若样品含抑菌成分（如臭氧），需中和处理（如加入硫代硫酸钠）。

环境与人员

实验需在洁净台（B级或更高）中进行，操作人员穿戴无菌手套、口罩及实验服。

实验台面用75%乙醇擦拭消毒。

二、操作流程

1.滤膜安装与系统灭菌

用无菌镊子将滤膜（光面向上）平铺于过滤器的支撑网上，固定滤杯。

连接抽滤装置，用无菌生理盐水预润湿滤膜，检查装置密封性。

2.样品过滤

取样体积：根据预期微生物污染水平选择（通常过滤100ml纯化水）。

过滤方法：

将样品倒入滤杯，开启真空泵抽滤至滤膜干燥（避免过度干燥导致微生物损伤）。

若样品体积大，可分次加入，每次过滤后暂停抽滤防止滤膜破裂。

3.滤膜转移与培养

用无菌镊子将滤膜转移至含R2A琼脂的培养皿中（光面贴培养基）。

培养条件：

细菌：30-35℃培养5-7天（需氧环境）。

霉菌和酵母菌：20-25℃培养3-5天（部分标准要求）。

4.阴性对照

同步操作空白对照（过滤等量无菌生理盐水），确保实验过程无污染。

三、结果判定

菌落计数

培养结束后，肉眼或放大镜计数滤膜上的菌落数（CFU）。

若菌落重叠或蔓延，以“实际可计数区域”报告。

计算公式

微生物限度（CFU/ml）=滤膜上菌落数×稀释倍数/过滤体积（ml）

纯化水标准：通常需符合企业内控标准（如细菌总数≤100CFU/ml）。

异常处理

若阴性对照出现菌落，实验无效需重做。

若样品菌落超标，需启动偏差调查（可能污染来源：水系统、取样或操作过程）。

四、注意事项

关键控制点

滤膜完整性：破损或皱褶的滤膜需弃用。

无菌操作：全程避免手部或环境接触滤膜及培养基。

干扰排除

高盐或低pH样品需调整至中性（pH6.5-7.5）。

若样品含颗粒物，需预过滤（如5μm滤膜）避免堵塞。

记录与报告

详细记录过滤体积、培养条件、菌落形态及数量。

出具报告时注明检测方法（薄膜过滤法）及判定依据（如ChP2020）。

五、常见问题与处理

滤膜堵塞：分次过滤或更换更大孔径预滤膜。

菌落过度生长：减少过滤体积或缩短培养时间。

假阴性风险：确认中和剂有效性及培养条件适宜性。

通过薄膜过滤法可高效检测纯化水中的微生物负荷，确保水质符合GMP或ISO标准要求。实际操作中需结合企业验证数据调整参数（如培养时间、培养基类型）。