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露地菊CgDREB22基因的克隆、特性解析与功能验证

一、引言

1.1研究背景与目的

植物在生长发育过程中，常常会遭遇各种非生物胁迫，如干旱、盐碱、低温等，这些胁迫严重影响植物的生长、发育、繁殖以及地理分布，对农业生产和生态环境造成巨大损失。据统计，全球每年因非生物胁迫导致的农作物减产高达50%以上。因此，提高植物的抗逆性，对于保障粮食安全、保护生态环境以及促进农业可持续发展具有至关重要的意义。

基因克隆技术作为现代分子生物学的核心技术之一，能够深入揭示植物抗逆的分子机制，为植物遗传改良提供关键基因资源。通过克隆与抗逆相关的基因，研究其功能和调控网络，我们可以精准地对植物进行遗传操作，培育出具有更强抗逆能力的新品种。例如，将耐旱基因导入农作物中，可使其在干旱条件下保持较好的生长状态，提高产量和品质。在花卉领域，基因克隆技术也有助于培育出更能适应恶劣环境的观赏植物品种，降低养护成本，扩大种植范围。

露地菊（Chrysanthemum×grandiflorum）作为一种重要的观赏花卉，具有适应性强、观赏价值高、栽培管理相对简单等特点，被广泛应用于城市园林景观、庭院绿化等领域。然而，在实际种植过程中，露地菊也会受到多种非生物胁迫的挑战，如北方地区冬季的低温、干旱，以及部分地区的土壤盐碱化等问题，这些都限制了露地菊的生长和观赏效果。因此，深入研究露地菊的抗逆分子机制，克隆关键的抗逆基因，对于培育抗逆性强的露地菊新品种具有重要的理论和实践意义。

本研究聚焦于露地菊CgDREB22基因，旨在通过基因克隆技术获得该基因的全长序列，并对其进行生物信息学分析，了解其结构和功能特征；通过实时荧光定量PCR等技术，研究该基因在不同非生物胁迫下的表达模式，揭示其在露地菊抗逆过程中的作用机制；进一步将该基因转化到烟草中，验证其抗逆功能，为露地菊的遗传改良提供理论依据和技术支持，也为其他植物的抗逆基因研究提供参考。

1.2AP2/ERF转录因子家族及DREB亚族研究进展

AP2/ERF（APETAL2/ethylene-responsiveelementbindingfactor）转录因子家族是植物中特有的一类转录因子，在植物的生长发育、激素信号转导、生物和非生物胁迫响应等过程中发挥着至关重要的作用。该家族成员的共同结构特征是含有一个或两个高度保守的AP2/ERF结构域，每个AP2/ERF结构域大约由60-70个氨基酸组成，具有特定的空间构象，能够与DNA序列特异性结合，从而调控下游基因的表达。根据AP2/ERF结构域的数量和序列特征，AP2/ERF转录因子家族可进一步分为AP2亚家族、ERF亚家族、DREB亚家族、RAV亚家族以及其他一些特殊成员。

DREB（Dehydration-ResponsiveElementBindingprotein）亚族是AP2/ERF转录因子家族中一个重要的亚家族，主要参与植物对非生物胁迫的响应。DREB亚族成员的AP2/ERF结构域能够特异性地识别并结合下游基因启动子区域中的DRE/CRT（Dehydration-ResponsiveElement/C-repeat）顺式作用元件，其核心序列为A/GCCGAC，从而激活或抑制这些基因的表达，启动植物的抗逆信号转导途径，增强植物对干旱、盐碱、低温等非生物胁迫的耐受性。

研究表明，DREB亚族成员在不同植物中的数量和功能存在一定差异。在拟南芥中，DREB亚族包含14个成员，根据其氨基酸序列的相似性和对不同胁迫的响应特性，可进一步分为A-1到A-6六个亚组。其中，A-1亚组的DREB1A/CBF3、DREB1B/CBF1和DREB1C/CBF2主要参与低温胁迫响应；A-2亚组的DREB2A和DREB2B则主要响应干旱和高温胁迫。在水稻中，已鉴定出30多个DREB基因，它们在水稻的生长发育和对多种非生物胁迫的响应中发挥着重要作用。例如，OsDREB1A基因的过表达能够显著提高水稻对低温和干旱的耐受性；OsDREB2A基因在干旱和盐胁迫下表达上调，通过调控下游一系列抗逆相关基因的表达，增强水稻的抗逆能力。

近年来，随着分子生物学技术的不断发展，对DREB亚族转录因子的研究取得了丰硕的成果。除了在模式植物中的深入研究外，在许多重要的农作物和经济植物中也开展了相关研究。例如，在小麦中，克隆和鉴定了多个DREB基因，并发现它们在小麦的抗逆过程中发挥着关键作用；在棉花中，通过转基因技术验证了GhDREB1基因能够提高棉花对干旱和盐胁迫的抗性。然而，目前对于DREB亚族转录因子的研究仍存在一些问题和挑战。一方面，虽然已经鉴定出