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苹果属小金海棠WRKY55与WRKY64基因的克隆鉴定及功能解析

一、引言

1.1研究背景

苹果（MaluspumilaMill.）作为蔷薇科苹果属的落叶乔木，原产于欧洲及亚洲中部，如今在全世界温带地区广泛种植，适生于海拔50-2500米的山坡梯田、平原矿野以及黄土丘陵等处。其不仅有着适宜的生长环境要求，如15-22℃的适宜温度，在土层深厚、含有丰富有机物、排水良好且能保持适量水分的壤土、粘壤土或砂壤土中生长更佳。早在公元前三世纪，苹果便已在罗马和希腊开始栽培，随后不断传播，成为世界上分布最广、栽培最盛的落叶果树之一。苹果树通常可高达15米，树冠多呈圆形，主干较短，小枝圆柱形，叶片为椭圆形、卵形至宽椭圆形，伞房花序具花3-7朵，花瓣呈倒卵形，果实扁球形，花期在5月，果期为7-10月。目前，全世界苹果栽培品种已超过7500种，具有极高的经济价值。其果实不仅可鲜食，含有丰富的蛋白质以及钙、铁等矿物元素，还能通过多种方式加工利用，如制作成果酒、果汁等；树皮可用于提取黄色染料，木材可制作手杖、家具等。此外，苹果在中医领域也有应用，果实、果皮和叶均可入药，可治疗津少口渴、脾虚泄泻等病症。2021年，全球苹果总产量达9314万吨，其中中国总产量为4597万吨；2022年，中国苹果产量依旧位居世界第一，年产量达4757.18万吨，占全球产量过半。

小金海棠（MalusxiaojinensisChengetJiang）作为珍贵的苹果物种资源，具有诸多优良特性。它分布在岷江上游和大渡河中上游流域之间的岷江-大渡河带，该地区苹果属植物种类丰富，小金海棠可能是物种分化及种质渗入形成的多倍体杂种，幼苗叶形与陇东海棠近似，应归属于陇东海棠系。小金海棠对多种逆境具有抗性，如抗盐、抗旱、抗寒，对苹果属植物常见的潜隐病毒也有一定抗性，尤为突出的是，它是全球范围内筛选出的第一个抗缺铁黄叶病苹果基因型。用作苹果砧木时，嫁接亲和性良好，还具有矮化效应以及高度的无融合生殖特性。

WRKY转录因子是高等植物特有的一类转录调控因子，在植物生命活动中占据着不可或缺的地位，是植物生长发育和逆境响应过程中的关键调控枢纽。自1994年首个WRKY转录因子SPF1从甘薯中被克隆出来后，相关研究不断深入，目前已在拟南芥、水稻、大豆、杨树、黄瓜、玉米等众多植物中分离鉴定到大量WRKY转录因子。该转录因子的主要结构特点是DNA结合域中至少含有1-2个WRKY结构域，这是一段由约60个高度保守氨基酸残基组成的多肽序列，其中WRKYGQK是所有成员中保守的7个氨基酸残基，并且其DNA结合域中一般还含有C2H2（C-X4-5-C-X22-23-H-X-H）或C2HC（C-X7-C-X23-H-X-C）型锌指结构。依据所含WRKY结构域的个数和锌指结构的特征，WRKY转录因子可分为3大类：GroupI含有2个WRKY保守结构域，C端锌指结构为C2H2型；GroupII只含1个WRKY保守结构域，锌指结构与I类相同；GroupIII锌指结构为C2HC型，包含1个WRKY保守结构域。WRKY转录因子能够通过WRKY结构域与靶基因启动子区的顺式作用元件TTGAC（C/T）核苷酸序列（W-box）特异性结合，从而促进或抑制转录，调控下游基因的表达。大量研究表明，WRKY转录因子广泛参与植物的生长发育过程，包括种子休眠与萌发、幼苗形态发生、抽穗期调控、叶夹角调节等，同时在应对生物胁迫（如病原菌侵害）和非生物胁迫（如干旱、低温、高盐等）中也发挥着关键作用。在植物应对病原菌侵害时，WRKY转录因子不仅可以激活植物抗毒素和细菌水解酶类等基因的表达，还参与调控植物中抗病信号分子如水杨酸、茉莉酸的合成。

然而，尽管目前对WRKY转录因子的研究取得了一定进展，但对苹果属植物中WRKY基因家族的研究仍相对较少。对于小金海棠这一具有独特优良性状的苹果种质资源，其WRKY基因家族成员的功能和作用机制更是知之甚少。深入研究小金海棠WRKY55与WRKY64基因，有助于揭示其在小金海棠生长发育和应对逆境过程中的分子调控机制，为苹果的遗传改良和抗逆育种提供理论依据和基因资源。

1.2国内外研究现状

在WRKY转录因子的研究方面，国外起步相对较早。1994年，Ishiguro等人首次从甘薯中克隆出WRKY转录因子SPF1，开启了WRKY转录因子研究的序幕。此后，在拟南芥中鉴定出74个WRKY