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反式茴脑生物合成茴香酸的工艺探索与优化

一、引言

1.1研究背景与意义

反式茴脑（trans-anethole），化学名为1-甲氧基-4-（1-丙烯基）-苯，是一种具有独特香气的化合物，在常温下为无色或微黄色液体或结晶，能与乙醚、氯仿混溶，可溶于乙醇、苯、乙酸乙酯等有机溶剂，几乎不溶于水。它广泛存在于八角茴香油、小茴香油等多种天然植物精油中，是这些精油的主要成分之一。在食品领域，反式茴脑常被用作香料，赋予食品独特的风味，如在烘焙食品、糖果、饮料等中，它能增添浓郁的茴芹香气，提升产品的口感和品质；在医药领域，它具有一定的生理活性，如抗菌、抗炎、抗氧化等作用，对某些疾病的预防和治疗具有潜在价值。

茴香酸（Anisicacid），化学名为对甲氧基苯甲酸（4-Methoxybenzoicacid），是一种白色结晶性固体，可溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂，微溶于热水，难溶于冷水。茴香酸具有广泛的应用价值，在香料行业，它是多种食品香料和工业香精的重要原料，能为香料增添独特的香气和风味；在医药领域，它可用作脑功能改善药茴拉西坦、抗心律失常药乙胺碘呋酮等多种药物的中间体，同时还具有抗肝毒活性和抗肿瘤活性；在化妆品行业，它可用作良好的抑菌剂，能有效抑制化妆品中微生物的生长，延长产品的保质期。

目前，工业生产茴香酸主要采用化学法，以对甲基苯酚、对羟基苯甲酸为原料合成而得。然而，化学法存在诸多问题，如生产成本较高，需要使用昂贵的原料和催化剂；工艺条件苛刻，需要高温、高压等剧烈的反应条件；副产物较多，会降低产品的纯度和收率；容易产生污染，对环境造成负面影响。随着人们对绿色化学和可持续发展的关注度不断提高，寻找一种经济、环保、高效的制备茴香酸的方法具有重要的现实意义。

微生物转化法作为一种绿色、环境友好型的生产方法，具有高效专一、反应条件温和、副产物少、对环境友好等优点。利用微生物转化反式茴脑合成茴香酸，不仅可以充分利用丰富的天然反式茴脑资源，还能避免化学合成法带来的诸多问题，符合可持续发展的理念。因此，开展反式茴脑生物合成茴香酸的工艺研究，对于推动香料产业的绿色发展、提高茴香酸的生产效率和质量、降低生产成本、减少环境污染等方面都具有重要的意义。

1.2国内外研究现状

国内外关于微生物转化法制备茴香酸的研究尚处于实验室阶段，主要聚焦在以反式茴脑或茴香油为底物转化合成茴香酸，研究内容包括菌株筛选、发酵条件优化和代谢相关基因或途径的探索等。

在菌株筛选方面，国内外学者已筛选出多种能够降解和转化反式茴脑的微生物。如ShimoniE等从土壤中获得一株能转化反式茴脑的细菌菌株TA13，经16SrDNA序列分析，鉴定为节杆菌Arthrobactersp.，该菌株及其诱变菌株能以反式茴脑、茴香醇和茴香醛作为碳源高产茴香酸。Ryu等报道在PseudomonasputidaJYR-1代谢茴香脑的转化液中，检测到了茴香脑环氧化合物、茴香酸及对羟基苯甲酸。国内陈敏获得一株茴香醛产率较高的菌株ZJ-9，初步鉴定为真菌黑曲霉，经转化条件的优化，茴香醛的摩尔转化率达4.54%。粟桂娇等以广西盛产的八角茴香油为碳源，获得一株细菌菌株BT-13，初步鉴定为假单胞菌Pseudomonassp.，经发酵条件优化，茴香醛的摩尔转化率可达7.7%，利用固定化细胞技术在两相系统中转化，茴香醛的产量有所提高，达12.6%。

在发酵条件优化方面，研究主要集中在碳氮源种类及浓度、反式茴脑添加量、发酵温度、接种量、初始pH以及装液量等因素对茴香酸生成量和反式茴脑降解率的影响。张健等利用单因素试验考察了这些因素对假单胞菌Pseudomonassp.NT2发酵生产茴香酸的影响，通过Plackett-Burman试验和最陡爬坡试验确定了影响茴香酸生成量的显著因素，最后采用Box-Behnken模型进行响应面优化，得到最佳发酵条件，优化后茴香酸生成量为7.24g/L，为优化前的3.5倍，茴香酸摩尔生成率为80.72%，反式茴脑降解率为89.81%。

在代谢相关基因或途径的探索方面，目前的研究还相对较少。部分研究通过分析微生物转化反式茴脑的中间产物，推测了可能的代谢途径。如通过高效液相色谱和气相色谱/质谱联用等手段分析假单胞菌和黑曲霉转化反式茴脑的中间产物，确定了假单胞菌转化反式茴脑的四种中间产物，分别为茴香环氧化物、茴香二醇、茴香醛和茴香酸；黑曲霉转化反式茴脑的五种中间产物，分别为茴香环氧化物、茴香二醇、茴香醇、茴香醛和茴香酸。

然而，目前的研究仍存在一些不足之处。一方面，已筛选出的菌株大多存在茴香酸生成率较低、稳定性差等问题，难以满足工业化