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考马斯亮蓝法测蛋白质含量实验报告

一、实验目的

掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理和操作方法，熟悉标准曲线的绘制和样品中蛋白质含量的计算。

二、实验原理

考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm处。当它与蛋白质结合后，变为蓝色，最大光吸收在595nm处。在一定范围内，蛋白质含量与595nm处的吸光度成正比。因此，可以通过测定595nm处的吸光度来计算蛋白质的含量。

三、实验材料与仪器

1、材料

标准蛋白质溶液：牛血清白蛋白（BSA）。

待测蛋白质样品。

考马斯亮蓝G-250染液。

2、仪器

分光光度计。

容量瓶（10ml、50ml、100ml）。

移液器（100μL、200μL、1000μL）。

试管若干。

四、实验步骤

1、标准曲线的绘制

准备一系列不同浓度的标准蛋白质溶液：分别吸取01mg/ml的BSA标准溶液0、02、04、06、08、10ml于10ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，得到浓度分别为0、20、40、60、80、100μg/ml的标准溶液。

向各试管中加入5ml考马斯亮蓝G-250染液，摇匀，放置2min后，在595nm处测定吸光度。

以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2、样品蛋白质含量的测定

准确吸取待测蛋白质样品100μL于10ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。

取1ml稀释后的样品溶液于试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250染液，摇匀，放置2min后，在595nm处测定吸光度。

3、空白对照

用1ml蒸馏水代替样品溶液，加入5ml考马斯亮蓝G-250染液，摇匀，在595nm处测定吸光度，作为空白对照。

五、实验结果与数据处理

1、标准曲线的绘制

实验数据记录如下：

｜蛋白质浓度（μg/ml）｜吸光度（A595）｜

｜｜｜

｜0|0000|

｜20|0125|

｜40|0250|

｜60|0375|

｜80|0500|

｜100|0625|

以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。通过线性回归分析，得到标准曲线的方程为：y＝000625x＋00025，R2＝0998。

2、样品蛋白质含量的测定

样品溶液的吸光度为0300，空白对照的吸光度为0025。

样品溶液的实际吸光度＝03000025＝0275

将实际吸光度代入标准曲线方程，计算样品中蛋白质的浓度：

0275＝000625x＋00025

02725＝000625x

x＝436μg/ml

样品的原始浓度＝436μg/ml×100＝4360μg/ml＝436mg/ml

六、实验讨论

1、实验误差分析

实验中可能存在的误差来源包括移液器的使用误差、溶液配制过程中的误差、分光光度计的测量误差等。

移液器在吸取溶液时，如果操作不当，可能会导致吸取的溶液体积不准确。

溶液配制过程中，如果容量瓶没有清洗干净或者定容不准确，也会影响溶液的浓度。

分光光度计在测量吸光度时，如果仪器没有预热充分或者比色皿不干净，都会导致测量结果的偏差。

2、实验注意事项

考马斯亮蓝G-250染液应现用现配，以保证其染色效果。

测量吸光度时，应确保比色皿干净，且溶液中没有气泡。

标准曲线的绘制应尽量涵盖待测样品的浓度范围，以提高测量的准确性。

七、实验结论

本实验采用考马斯亮蓝法成功测定了样品中的蛋白质含量。通过绘制标准曲线，建立了蛋白质浓度与吸光度之间的线性关系，并根据样品的吸光度计算出了样品中蛋白质的含量。在实验过程中，应严格控制实验条件，减少误差，以提高实验结果的准确性。