大肠杆菌基因工程.pptxVIP

大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程第1页

基因工程523416789基因工程基础概念基因工程基础原理基因工程所需基础条件基因工程操作过程目标基因克隆与基因文库构建大肠杆菌基因工程酵母基因工程哺乳动物基因工程高等植物基因工程大肠杆菌基因工程第2页

D基因工程菌遗传不稳定性及其对策6大肠杆菌基因工程C大肠杆菌基因工程菌构建策略B外源基因在大肠杆菌中高效表示原理A大肠杆菌作为表示外源基因受体菌特征E利用重组大肠杆菌生产人胰岛素大肠杆菌基因工程第3页

A大肠杆菌作为表示外源基因受体菌特征6大肠杆菌基因工程大肠杆菌表示外源基因优势全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表示系统成熟完善繁殖快速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA同意为安全基因工程受体生物大肠杆菌基因工程第4页

A大肠杆菌作为表示外源基因受体菌特征6大肠杆菌基因工程大肠杆菌表示外源基因劣势缺乏对真核生物蛋白质复性功效缺乏对真核生物蛋白质修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确异源蛋白细胞周质内含有种类繁多内毒素大肠杆菌基因工程第5页

B外源基因在大肠杆菌中高效表示原理6大肠杆菌基因工程开启子终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数大肠杆菌基因工程第6页

开启子开启子最正确距离探测目标基因EEAEE开启子A酶切开Bal31酶解目标基因大肠杆菌基因工程第7页

开启子开启子筛选AprorigalKpKO1终止密码子采取鸟枪法战略，将适当大小DNA片段克隆到开启子探针质粒pKO1上受体细胞染色体DNA上galE、galT与质粒上汇报基因galk表示产物联合作用，可将培养基中半乳糖酵解成红色素物质转化galE+、galT+、galK-大肠杆菌受体菌株含有外源开启子活性重组克隆大肠杆菌基因工程第8页

开启子开启子构建-35区序列-10区序列PlLPrecAPtrpPlacPtraAPtac开启子TTGACAGATACTTTGATATATAATTTGACATTAACTTAGACATAATGTTTTACATATAATTTGACATATAATPtac=3Ptrp=11Plac大肠杆菌基因工程第9页

开启子开启子可控性P乳糖开启子Plac可控性：OPO高效转录阻遏蛋白诱导乳糖异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型Plac与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基基底水平转录底水平表示；诱导物能够使开启子Plac介导转录大幅提升大肠杆菌基因工程第10页

开启子开启子可控性Plac乳糖开启子Plac可控性：OPlacO高效转录葡萄糖代谢野生型Plac上游附近拥有代谢激活因子（CAP）结合区，cAMP激活CAP，CAP基底水平转录结合开启子控制区，进而促进Plac介导转录。葡萄糖代谢使cAMP降低，也能阻遏Plac介导转录。所以，基因工程中使用乳糖开启子均为抗葡萄糖代谢阻遏突变型，即PlacUV5CAPcAMPcAMP浓度降低PlacUV5O高效转录大肠杆菌基因工程第11页

开启子开启子可控性Ptrp色氨酸开启子Ptrp可控性：Otrp除去色氨酸色氨酸开启子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物阻遏，转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸基底水平转录或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常细菌培养体系中，除去色氨酸是困难，所以基因工程中往往添加IAA诱导Ptrp介导目基因表示色氨酸或加3-吲哚丙烯酸高效转录阻遏蛋白（IAA）OtrpPtrp高效转录OtrpPtrp大肠杆菌基因工程第12页

开启子开启子可控性l噬菌体开启子PlL可控性：噬菌体开启子PL受CI阻遏蛋白阻遏，极难直接诱导控制。在基因工程中常使用温度敏感型cI突变基因cI857控制PL。cI857阻遏蛋在42℃时失活脱落，PL便可介导目标基因表示。但在大型细菌培养罐中快速升温非常困难，因此常使用一个双质粒控制系统，用色氨酸间接控制目标基因表示PtrpABcI857PL目标基因阻遏作用PtrpABPL表示色氨酸大肠杆菌基因工程第13页

终止子强化转录终止必要性外源基因在强开启子控制下表示，轻易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近DNA序列，形成长短不一mRNA混合物过长转录物产生在很大程度上会影响外源基因表示，其原因以下：转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需时间就对应增加，外源基因本身转录效率下降；假如外源基因下游紧接有载体上其它主要基因或DNA功效区域，