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基于苹果DHAR基因的仙客来遗传转化体系构建与应用研究

一、引言

1.1研究背景与目的

1.1.1研究背景

在植物的生长发育进程中，其细胞会不可避免地受到各种环境胁迫，如干旱、高温、低温、盐渍以及病原菌侵染等。这些胁迫会导致植物细胞内活性氧（ROS）大量积累，包括超氧阴离子（O_2^-）、过氧化氢（H_2O_2）和羟自由基（·OH）等。过量的ROS会攻击细胞内的脂质、蛋白质和核酸等生物大分子，引发膜脂过氧化、蛋白质变性和DNA损伤，严重影响细胞的正常生理功能，甚至导致细胞死亡。因此，植物进化出了一套复杂而精细的抗氧化防御系统，以维持细胞内的氧化还原平衡，抵御ROS的伤害。

抗坏血酸（Ascorbicacid，AsA），又称维生素C，是植物体内一种重要的水溶性抗氧化剂，在植物的抗氧化防御系统中占据核心地位。AsA不仅可以直接清除细胞内的ROS，如与H_2O_2反应生成单脱氢抗坏血酸（MDHA），还参与了植物体内多个重要的生理过程，如光合作用、激素合成和信号转导等。在光合作用中，AsA可以保护光合机构免受光氧化损伤，维持光合电子传递链的正常运转；在激素合成方面，AsA参与了生长素、乙烯等激素的合成过程，影响植物的生长发育和对环境胁迫的响应。

然而，AsA在清除ROS的过程中会被氧化为脱氢抗坏血酸（DHA），如果不能及时被还原为AsA，细胞内的AsA含量就会逐渐降低，抗氧化能力也会随之下降。此时，脱氢抗坏血酸还原酶（Dehydroascorbatereductase，DHAR）发挥着关键作用。DHAR以还原型谷胱甘肽（GSH）为底物，催化DHA还原为AsA，从而实现AsA的再生，维持细胞内AsA的含量和氧化还原状态。这一过程不仅保证了AsA的持续供应，使其能够持续发挥抗氧化作用，还维持了细胞内GSH的氧化还原平衡，因为GSH在还原DHA的过程中会被氧化为氧化型谷胱甘肽（GSSG），而GSSG又可以通过谷胱甘肽还原酶（GR）的作用重新还原为GSH，形成一个完整的抗坏血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循环。AsA-GSH循环是植物抗氧化防御系统的重要组成部分，该循环中的关键酶如DHAR、APX（抗坏血酸过氧化物酶）、MDHAR（单脱氢抗坏血酸还原酶）和GR等协同作用，能够高效地清除细胞内的ROS，保护植物细胞免受氧化损伤。众多研究表明，提高植物体内DHAR的活性或表达水平，可以增强植物对多种逆境胁迫的抗性。例如，在干旱胁迫下，过表达DHAR基因的植物能够维持较高的AsA含量和较低的ROS水平，从而减轻干旱对植物造成的伤害，表现出更好的生长状态和抗旱性；在盐胁迫条件下，DHAR基因表达上调的植物对盐分的耐受性增强，能够在高盐环境中正常生长和发育。

仙客来（CyclamenpersicumMill.）作为世界著名的观赏花卉，以其优美的花形、绚丽的花色和较长的花期，深受人们的喜爱，在全球观赏植物市场中占据重要地位。它原产于地中海地区，目前在世界各地广泛栽培，被广泛应用于室内盆栽观赏、庭院布置以及城市园林绿化等领域。随着人们生活水平的提高和对美好生活的向往，市场对仙客来的需求不断增加，不仅要求其具有更高的观赏品质，如更大的花朵、更丰富的花色和更紧凑的株型，还期望其具备更强的抗逆性，以适应不同的生长环境和栽培条件。然而，仙客来在生长过程中常常受到多种逆境胁迫的影响，如夏季高温、冬季低温、土壤盐渍化以及病虫害的侵袭等。这些逆境胁迫不仅会导致仙客来生长发育不良，花朵变小、花色变淡，花期缩短，严重影响其观赏价值和商品价值，还会增加栽培管理的难度和成本，限制其在更广泛地区的种植和推广。传统的仙客来育种方法主要依赖于杂交育种，通过人工杂交将不同品种的优良性状组合在一起，培育出新品种。然而，这种方法周期长、效率低，且受到亲本遗传背景的限制，难以快速有效地引入新的优良基因。随着现代生物技术的飞速发展，基因工程技术为仙客来的遗传改良提供了新的途径。通过基因工程手段，可以将外源的优良基因导入仙客来基因组中，使其获得原本不具备的优良性状，如抗逆性、花色改良等，从而实现仙客来的快速定向育种。

1.1.2研究目的

本研究旨在构建携带DHAR基因的植物表达载体，并通过农杆菌介导法将其转化到仙客来中，期望实现以下具体目标：一是通过导入DHAR基因，提高仙客来体内AsA的再生能力，增强其抗氧化防御系统，从而提高仙客来对干旱、盐渍、高温和低温等逆境胁迫的抗性，使其能够在更恶劣的环境条件下生长和发育，减少逆境对其生长和观赏品质的影响；二是对转化后的仙客来植株进行分子生物学检测和生理生化分析，验证DHAR基因在仙客来中的整合、表达和功能，为进