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石蜡切片的详细制作过程

石蜡切片技术作为组织学研究和临床病理诊断中最常用、最基础的技术手段之一，其制作过程的精细程度直接影响到后续染色观察的效果和诊断的准确性。一项优质的石蜡切片，不仅要求组织形态结构保存完好，无明显收缩、变形或人为损伤，还需要切片薄而完整、平整无褶皱。下面将详细阐述石蜡切片从组织取材到切片完成的整个流程及关键技术要点。

一、实验准备与组织接收

在开始石蜡切片制作之前，充分的准备工作是确保实验顺利进行的基础。首先，需对接收的组织标本进行仔细核对，包括患者信息、组织名称、固定液种类及固定时间等，确保标本信息准确无误。同时，观察组织的大小、质地、色泽，初步判断其是否适合进行常规石蜡切片处理。对于过大或不规则的组织，可能需要在固定前或固定后进行适当的修整，以保证组织块的大小适中（通常建议不超过2cm×2cm×0.3cm），便于后续处理。

实验用品的准备同样重要。需准备好各级别乙醇（70%、80%、90%、95%、无水乙醇）、透明剂（如二甲苯）、石蜡（根据季节和组织类型选择不同熔点的石蜡，一般为52-60℃）、包埋盒、脱水盒、标签、毛笔、镊子、刀片等。相关仪器如脱水机、包埋机、切片机也需提前检查调试，确保运行正常。此外，个人防护用品如实验服、手套、口罩等应佩戴齐全，尤其在操作有毒挥发性试剂（如甲醛、二甲苯）时，务必在通风橱内进行。

二、组织固定

组织固定是石蜡切片制作中至关重要的第一步，其目的在于迅速终止组织细胞的生命活动，防止组织自溶与腐败，尽可能保持组织细胞离体时的原有形态结构和化学成分。常用的固定剂为10%中性缓冲福尔马林（4%甲醛溶液），其渗透力强，固定效果好，对组织刺激性相对较小。

固定操作时，将修整好的组织块放入合适的容器中，加入足量的固定液，固定液的用量一般为组织体积的5-10倍。若组织块较大或较致密，应适当增加固定液用量或延长固定时间。固定时间需根据组织类型、大小及固定液种类灵活掌握，通常情况下，常规组织固定12-24小时即可。固定温度以室温为宜，特殊情况下可采用低温或加温固定，但需谨慎控制。固定过程中，应确保组织块完全浸没于固定液中，避免组织与容器壁粘连，必要时可轻轻晃动容器以促进固定液渗透。对于某些特殊组织，如皮肤、骨组织等，可能需要特殊的固定方法或固定液。

三、组织脱水

组织经固定后，内部含有大量水分，而石蜡为脂溶性物质，无法与水混溶。因此，必须通过脱水步骤将组织中的水分彻底去除，为后续的透明和浸蜡创造条件。脱水过程通常在脱水机内自动完成，也可手工操作，核心是利用脱水剂（通常为乙醇）的梯度浓度变化，逐步置换组织内的水分。

常规脱水程序如下：组织从固定液中取出后，先用流水冲洗（若使用福尔马林固定，此步骤可去除未结合的甲醛，减少其对后续染色的影响），然后依次移入70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇（Ⅰ）、95%乙醇（Ⅱ）、无水乙醇（Ⅰ）、无水乙醇（Ⅱ）中进行脱水。各级乙醇的脱水时间需根据组织大小和类型进行调整，一般每级停留1-2小时。脱水原则是从低浓度乙醇开始，逐渐过渡到高浓度乙醇，避免组织因脱水过快而发生剧烈收缩或硬化。在无水乙醇阶段，通常需要更换两次，以确保彻底脱水。脱水不足会导致后续透明不完全、浸蜡不充分，切片易碎裂；而脱水过度则可能使组织过硬、变脆，同样不利于切片。

四、组织透明

透明是脱水后的关键步骤，其目的是利用透明剂置换组织内的脱水剂（乙醇），使组织变得透明，同时也为石蜡的渗入开辟道路，因为透明剂既能与乙醇互溶，又能与石蜡互溶。常用的透明剂为二甲苯，其透明能力强，速度快，但对组织有一定的硬化作用且易挥发、有刺激性。

透明过程同样在脱水机或手工操作下进行，将脱水后的组织从无水乙醇中取出，移入二甲苯（Ⅰ）和二甲苯（Ⅱ）中。透明时间需严格控制，一般各级15-30分钟。透明程度的判断很重要，通常以组织块呈现均匀的透明状、组织内部结构清晰可见为宜。透明不足，石蜡难以渗入；透明过度，则组织会变得过于脆硬，易导致切片时碎裂或出现裂隙。对于一些较硬或较大的组织，透明时间可适当延长，但需密切观察，防止过度透明。

五、组织浸蜡

浸蜡是将透明剂置换出来，使石蜡分子渗入到组织细胞间隙，从而支撑组织，使其在切片时能够保持完整的形态。浸蜡所用的石蜡应纯净、无杂质，熔点选择需根据当地气候和组织特性，夏季可选用较高熔点（56-60℃）的石蜡，冬季可选用较低熔点（52-54℃）的石蜡。

浸蜡过程需在恒温培养箱或专用浸蜡机中进行，温度设定应略高于石蜡的熔点（通常高2-3℃），以保证石蜡处于熔融状态但又不会因温度过高而破坏组织成分。将透明后的组织依次移入溶有少量透明剂的石蜡（Ⅰ）和纯石蜡（Ⅱ、Ⅲ）中进行浸蜡。浸蜡时间根据组织大小和类型而定，一般每级1-3小时。浸蜡次数通常为2-3次，以确保组织内的透明剂被石蜡完全取