WesternBlot实验技术课件.pptxVIP

蛋白质电泳转膜技术蛋白质电泳转膜技术是生物化学实验中常用的分析方法,能够有效分离和鉴定目标蛋白。本课件将详细介绍该技术的原理、实验步骤和注意事项,帮助大家掌握这一重要的实验技术。ZPbyZhiruiPu

实验原理免疫亲和层析WesternBlot技术是基于免疫亲和层析的原理,利用抗原抗体特异性结合进行检测。待测蛋白经电泳分离后转移到膜上,然后与特异性抗体孵育,通过免疫显色可以检测出目标蛋白的存在及含量。蛋白电泳分离通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)可以将复杂的蛋白样品进行高分辨率分离,使得每种蛋白能够单独呈现在膜上。这为后续的免疫检测提供了良好的基础。

实验步骤样品准备根据实验要求采集样品并制备。样品应充分裂解,蛋白浓度可通过BCA法检测。电泳分离将样品及标准蛋白上样至SDS胶中,进行电泳分离。电泳过程中,蛋白质会按分子量大小进行分离。电转膜将分离好的蛋白质从凝胶转移到PVDF或硝酸纤维膜上,以便后续免疫检测。转膜过程中需控制电压和时间。免疫探测先用阻断液封闭膜表面,然后依次加入一抗、洗膜、加入二抗、洗膜,最后进行显色检测。

实验材料准备1缓冲液制备根据实验需求,准备各种缓冲液,如裂解缓冲液、电泳缓冲液、洗涤缓冲液等,确保浓度和pH值合适。2检测试剂准备准备一抗、二抗、显色试剂等检测所需的各种试剂溶液,合适的浓度和温度非常重要。3耗材准备如电泳槽、电转槽、孵育盒、移液枪等实验耗材,检查状态并做好标记,确保实验顺利进行。4蛋白样品准备根据样品性质,选择合适的裂解方法和溶剂,提取并定量蛋白样品。

样品制备1取样从实验对象中采集样品2处理根据实验需求对样品进行处理3提取提取目标蛋白样品制备是WesternBlot实验的关键一步。首先需要从实验对象中准确采集样品,如细胞或组织。然后根据实验需求,对样品进行必要的处理,如分离、溶解、检测浓度等。最后从处理后的样品中提取目标蛋白。这一系列过程保证了实验样品的质量和代表性。

电泳1样品上样将准备好的蛋白质样品加入上样缓冲液后小心加载至凝胶孔中。2电泳分离通入电流,蛋白质在凝胶中根据分子量大小进行分离迁移。3电泳终止电泳过程结束后,停止电流,取出凝胶继续后续的转膜步骤。

转膜1电泳分离样品经电泳分离2转膜将分离好的蛋白质转移到膜上3固定将蛋白质牢固地固定在膜上转膜过程将电泳分离后的蛋白质转移到膜上,并将其牢固地固定在膜上,为后续抗体检测做好准备。这一步非常关键,需要保证蛋白质的完整性和位置信息的准确性。

封闭1选择合适膜根据蛋白质的特点和实验需求选择合适的NC膜或PVDF膜2完全遮蔽用无脂奶粉或BSA溶液将膜表面完全覆盖3充分反应在室温或4°C下孵育一定时间,使膜与封闭液充分反应封闭是WesternBlot实验中关键的一步,通过填充膜表面上所有可能结合一抗或二抗的位点,避免非特异性结合,确保后续检测结果的特异性和准确性。合理选择封闭剂并控制好反应时间至关重要。

一抗孵育1选择合适抗体根据目标蛋白的特性和实验目的,仔细选择特异性强、亲和力高的初级抗体。2缓冲液准备准备含有BSA或脱脂奶粉的缓冲液,用于抗体孵育和洗膜。3抗体稀释根据抗体的浓度和实验经验,将初级抗体适当稀释后加入含有样品的膜中。

洗膜1取下膜小心翼翼取下电泳转移的膜2清洗缓冲液使用TBST或PBS缓冲液洗涤膜3重复洗涤重复3-5次洗涤以彻底清洗洗膜是WesternBlot实验中的关键步骤之一,旨在去除膜上多余的抗体和非特异性结合。通过反复清洗,可以有效降低背景噪音,提高检测的特异性和灵敏度。在正确执行洗膜步骤后,膜上只会保留目标蛋白与一、二抗的特异性结合。

二抗孵育加入二抗溶液将膜放入含有二抗的缓冲液中,轻轻摇晃孵育,使二抗与目标蛋白充分结合。控制孵育时间根据二抗的类型和浓度,选择合适的孵育时间,通常为1-2小时。密闭孵育将装有膜和二抗溶液的容器密闭,避免溶液蒸发和膜干燥。

洗膜1漂洗在显色后,需要用大量的TBST缓冲液对膜进行多次漂洗,以去除残余的显色试剂。这一步非常关键,可以确保背景干净,提高信号噪音比。2吸干在完成最后一次洗膜后,用吸水纸或洁净的毛巾轻轻吸干膜上残留的缓冲液。这可以防止膜在后续步骤中被稀释试剂冲淡。3保存洗膜完成后,可以将膜置于封塑膜袋中保存,避免暴露在空气中干燥。保存在4℃冰箱内可延长膜的使用寿命。

显色选择合适探针根据目标蛋白的特性选择合适的化学发光或fluorescent探针,确保探针能特异性识别目标蛋白。反应底物加入将化学发光底物或fluorescent底物溶液均匀涂覆于膜表面,确保膜完全接触到底物溶液。曝光显影将膜置于成像设备中,根据探针的发光强度和信号时间特性进行曝光拍摄,获得蛋白条带的图像。

结果分析对照分析将实验样品的结果与阴性和阳性对照进行比较分析,确认实验是否成功。定性评估观察目标蛋